小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒

注意事項：※※※
1.試劑盒應在有效期內使用，請不要使用過期的試劑。
2.試劑盒未使用時應保存在2-8℃冰箱，已復溶但未用完的標準品，請丟棄。
3.試劑盒使用前請在室溫恢復30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。
4.在試驗中標準品和樣本建議作復孔檢測，且加入試劑的順序應保持*。
5.為避免交叉污染，請在試驗中使用1次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容器。.
6.濃縮生物素化抗體和濃縮酶結合物的體積較少，在運輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶 蓋上，使用前請離心處理（5-10 S即可），使管壁上的液體集中在管底部，取用時，請用移液器小心吹打幾次。
7.除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內含的        試劑代替本試劑盒中的某單個組分。
8.為保證結果準確，每次檢測均需做標準曲線。

安全提示：

試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時請帶上手套并注意防護；在操作過程中也要避免試劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請用大量清水清洗；檢測血液樣本及其它體液樣本時，請按國家生物實驗室安全防護有關管理規定執行。

自備實驗器材（不提供，可代購）
1．酶標儀（主波長450nm，參考波長630nm）
2．高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3．洗板機或洗瓶
4．37℃孵育箱
5．雙蒸水，去離子水，量筒等
6．稀釋用聚丙烯試管
 

小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒

樣本收集及儲存：
1.細胞培養上清：
將細胞培養基移無菌離心管，在4℃條件下1000×g離心10 min,然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存（24小時內檢測可放入2-8℃儲存），避免反復凍融。
2.血清樣本：
室溫血液自然凝固20 min后，在4℃條件下1000×g離心10 min，然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存（24小時內檢測可放入2-8℃儲存），保存過程中如有沉淀，請再次離心，避免反復凍融。
3.血漿樣本：
將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據標本的實際要求選擇EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合20 min，在4℃條件下1000×g離心10 min，然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存（24小時內檢測可放入2-8℃儲存），避免反復凍融。

※注意：

血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結果；如果樣本中的靶標物檢測濃度高于標準品的值，請將樣品做適當倍數稀釋后檢測，建議正式實驗前做預實驗以確定稀釋倍數。

 

小鼠腫瘤壞死因子α

試劑準備：
1.試劑回溫：首先在實驗前30 min將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現結晶，請放入37℃溫浴直到結晶全部溶解。
2.配制洗滌液：預先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將20倍濃縮洗滌液稀釋成1倍應用液，未用完的濃縮洗滌液放入4℃冰箱保存。
3.標準品梯度稀釋：加入標準品/樣本稀釋液（SR1）1ml凍干標準品中，靜置15分鐘待其*溶解后輕輕混勻(濃度為2000pg/ml)，然后按照以下濃度：2000、1000、 500、 250、125、62.5、31.25、 0 pg/ml進行稀釋。復溶過的標準品原液（2000pg/ml）未用完的應廢棄或根據需要按照一次用量分裝，并將其貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖。

4.生物素化抗體工作液：預先計算好試驗所需用量，用生物素化抗體稀釋液（SR2）將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍應用工作液（稀釋前充分混勻），請在30分鐘內加入到反應孔中。




5.酶結合物工作液：按每次試驗所需用量配制，用酶結合物稀釋液（SR3）將40倍濃縮酶結合物稀釋成1倍應用工作液（稀釋前離心），請在30分鐘內使用。



6.洗滌方法：
?自動洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，注入洗滌液為300ul/孔,注與吸出間隔為30秒，洗板5次。
?手工洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液300ul/孔，靜止30秒后甩凈酶標板孔中液體，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板5次。
 

結果判斷：
1.用酶標儀 450 nm 波長測定 OD 值。選擇雙波長檢測，參考波長為 630 nm。如不能進行雙波長檢測，請用 450 nm 的OD測定值減去630 nm的OD測定值。
2.計算標準品、樣品的平均OD值：每個標準品和標本的OD值應減去零孔的OD值
3.以標準品濃度為橫坐標，吸光度OD值為縱坐標，用軟件繪制標準曲線，樣品中TNF-α含量可通過對應OD值由標準曲線換算出相應的濃度。
4.若標本OD值高于標準曲線上限，應做適當稀釋后重新檢測，計算濃度時再乘以稀釋倍數。

TNF-αELISA KIT（Mouse）參數表征：

1. 數據及標準曲線

本圖僅供參考，應以當次試驗標準品繪制的標準曲線計算小鼠TNF-α的樣本含量

2. 靈敏度：
低可檢測小鼠TNF-α濃度達15pg/ml，
20個零標準品濃度OD的平均值加上兩個標準差，計算相應的可檢測濃度。

3. 特異性：
不與小鼠M-CSF 、GM-CSF、LIF、SCF、TNF-β、VEGF等反應，人的TNF-α、TNF sRI、TNF sRII等反應

4. 重復性：
板內，板間變異系數<10%

5. 回收率：
在選取的健康小鼠血漿、細胞培養上清中加入 3 個不同濃度水平的小鼠TNF-α，計算回收率。

6. 線性稀釋：
分別在選取的4 份健康小鼠血漿和細胞培養上清中加入高濃度小鼠 TNF-α，在標準曲線動力學范圍內進行稀釋，評估線性。

常見問題及解決方法：