轉氫酶-2（TH-2）活性檢測試劑盒說明書
微量法
貨號：BC3265
規格：100T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑一：臨用前取1瓶加入3mL試劑三。用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復凍融。

2. 試劑二：臨用前取1瓶加入10 mL試劑三備用。用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融。（1瓶粉劑溶解可做100T，為了延長使用時間，此產品多給1瓶粉劑）

產品說明：
轉氫酶位于線粒體的內膜上，又稱為線粒體復合體六，催化NADH+NADP⁺和NAD⁺+NADPH相互轉化，調節線粒體NAD(H)和NADP(H)平衡。把逆向反應稱為TH-2，催化NADPH和NAD⁺生成NADP⁺和NADH。
NADH和NADPH均在340nm有特征吸收，因此TH催化的轉氫反應不能導致340nm吸光度發生變化。用人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸（APAD⁺）替代NAD⁺，TH-2催化APAD⁺還原生成APADH，APADH在375nm有特征光吸收，測定375nm光吸收的增加速率，來計算TH-2活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：具體操作步驟詳見“產品資料"附件

注意事項：

1. 如果測定的吸光值過高（高于1.5）或者ΔA大于0.25時，可用提取液或試劑三稀釋上清液后再測定。

2. 樣本蛋白濃度需自行測定。由于提取液中含有一定濃度的蛋白（約1mg/mL），所以在測定樣本蛋白濃度時需要減去提取液本身的蛋白含量。

3. ΔA對照或ΔA測定出現負值為正常現象。

4. 推薦使用樣本蛋白濃度計算酶活，若用樣本質量計算，則需加測胞漿提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方為總酶活。

5. 本試劑盒試劑足夠完成100管反應。

6. 附:按樣本重量計算公式：（樣本檢測數為100T/24S）

（1）按微量石英比色皿計算
A、上清中TH-2活力的計算
單位的定義：每g組織在反應體系中每分鐘產生1 nmol APADH定義為一個酶活性單位。
TH-2（U/g 質量）=[ΔA1×V反總÷（ε×d）]÷(W÷V提取×V樣) ÷T=498×ΔA1÷W
ΔA1：上清測定值；V反總：反應體系體積，0.2mL；ε：APADH的消光系數，6.7×10^-3mL/nmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V提取：加入提取液體積，1.0mL；V樣：樣本體積，0.02mL； T：反應時間，3min。
B、沉淀中TH-2活力的計算
單位的定義：每g組織在反應體系中每分鐘產生1 nmol APADH定義為一個酶活性單位。
TH-2（U/g 質量）=[ΔA2×V反總÷（ε×d）]÷(W÷V提取×V樣) ÷T=398×ΔA1÷W
ΔA2：沉淀測定值；V反總：反應體系體積，0.2mL；ε：APADH的消光系數，6.7×10^-3mL/nmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V提取：復溶沉淀的提取液體積，0.8mL；V樣：樣本體積，0.02mL；T：反應時間，3min。

C、樣本TH-2總活力的計算
樣本TH-2總活力即為上清中TH-2活力與沉淀中TH-2活力之和。
按樣本質量計算：TH-2（U/g 質量）=498×ΔA1÷W+398×ΔA2÷W
（2）按96孔UV計算
將計算公式中的d-1cm換為d-0.6cm（96孔UV板光徑）進行計算即可。
參考文獻：

1. Vandock K P, Drummond C A, Smith S L, et al. Midgut and fatbody mitochondrial transhydrogenase activities during larval-pupal development of the tobacco hornworm, Manduca sexta[J]. Journal of insect physiology, 2010, 56(7): 774-779.

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