單寧酶活性檢測試劑盒說明書

微量法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。
貨號：BC4075
規(guī)格：100T/48S
產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑一：臨用前取1支加入1 mL無水乙醇混勻溶解，用不完的試劑可以2-8℃保存一周；（1支粉劑溶解后可做100T，為了延長使用時間，此產(chǎn)品多給1支粉劑）

2. 標(biāo)準(zhǔn)品：5 mg沒食子酸丙酯。臨用前加入1.178 mL無水乙醇充分混勻溶解，配成20 μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，2-8℃保存兩周。

產(chǎn)品說明：
單寧酶全稱是單寧酯酰水解酶(Tannase，EC 3.1.1.20)，存在于富含單寧的植物，也廣泛存在于微生物中，可以水解酯鍵和縮酚羧鍵，生成沒食子酸和葡萄糖。
使用沒食子酸丙酯（PG）作為單寧酶酶促反應(yīng)的底物，其在270nn下有特征吸收峰，根據(jù)其反應(yīng)前后吸光度的變化來計算單寧酶活力。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔UV板、低溫離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、超聲破碎儀、研缽/勻漿器、乙醇、冰和蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見“產(chǎn)品資料"附件
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）
1、組織：稱取約0.1g組織，加入1mL提取液，冰浴勻漿。10000rpm 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2、細(xì)胞或細(xì)菌樣本的制備：先收集細(xì)胞或細(xì)菌樣本到離心管內(nèi)，棄上清，按照每500萬細(xì)胞或細(xì)菌加入1mL提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）。10000rpm，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
二、測定步驟

1. 紫外分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，波長調(diào)至270nm，紫外分光光度計蒸餾水調(diào)零。

2. 標(biāo)準(zhǔn)液的稀釋：取5μL 20μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入1995μL提取液，充分混勻，配制成0.05μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液使用，現(xiàn)用現(xiàn)配。（實驗中每管需要200μL，為減小實驗誤差，故配制大體積。）

3. 對照管樣本處理：吸取0.02mL樣本于1.5mLEP管中作為對照管，沸水浴5min，冷卻至常溫待測。

4. 加樣表（在1.5mLEP管中分別加入）

注意事項：
如果A測定大于1.5，可以適當(dāng)加大稀釋倍數(shù)，保證總體積0.2mL不變，如5μL上清液和195μL提取液（相當(dāng)于F=200/5=40），計算公式中需改變F和V上清液的數(shù)值。
實驗實例：

1. 取0.1g玉蘭葉加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清后按照測定步驟操作，用微量石英比色皿測得計算ΔA測定=A對照管-A測定管=0.6631-0.6258=0.0373，按樣本質(zhì)量計算酶活得：單寧酶（U/g質(zhì)量）=1000×ΔA÷A標(biāo)準(zhǔn)÷W×F（稀釋倍數(shù)）=1119 U/g 質(zhì)量。

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