肉桂酸-4-羥化酶（C4H）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書
微量法
貨號(hào)：BC4085
規(guī)格：100T/96S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前取一瓶粉劑加入2 mL乙醇溶解備用。2-8℃保存4周。

2. 試劑三：臨用前取一瓶粉劑加入2 mL雙蒸水充分溶解待用。現(xiàn)配現(xiàn)用。-20℃分裝可保存4周，避免反復(fù)凍融。

產(chǎn)品說(shuō)明：
C4H又稱反式肉桂酸-4-單氧化酶，是催化桂皮酸形成咖啡豆、香豆酸的酶。C4H多存在于高等植物、酵母、菌類中，屬于細(xì)胞木質(zhì)素合成途徑中間的關(guān)鍵酶。
C4H催化肉桂酸和NADPH生成4-香豆酸鹽和NADP，在340nm下測(cè)定NADPH的減少速率，即可反映C4H活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研缽/勻漿器、乙醇、冰和蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見“產(chǎn)品資料"附件

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）
1、組織：稱取約0.1g組織，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿。12000g 4℃離心15分鐘，取上清，置冰上待測(cè)。
2、細(xì)胞或細(xì)菌樣本的制備：先收集細(xì)胞或細(xì)菌樣本到離心管內(nèi)，棄上清，按照每500萬(wàn)細(xì)胞或細(xì)菌加入1mL提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）。12000g，4℃離心15min，取上清，置冰上待測(cè)。
二、測(cè)定步驟

1. 紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，波長(zhǎng)調(diào)至340nm，紫外分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。

2. 加樣表（微量石英比色皿/96孔UV板中分別加入）

充分混勻后立即測(cè)定10s時(shí)在340nm下的吸光度，記為A1，之后迅速將其放入37℃水浴或37℃培養(yǎng)箱中3min（若酶標(biāo)儀帶有控溫功能，將溫度調(diào)為37℃）。然后迅速拿出擦凈后測(cè)定190s時(shí)的吸光度，記為A2。計(jì)算ΔA=A1-A2。

注意事項(xiàng)：
當(dāng)ΔA大于0.4時(shí)，建議將樣本用提取液稀釋后測(cè)量；ΔA過(guò)小時(shí)，建議增加酶促反應(yīng)時(shí)間（5min或10min）或增加加入的樣本體積來(lái)測(cè)定。
實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1g黃豆（發(fā)芽）加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清后按照測(cè)定步驟操作，使用微量石英比色皿測(cè)得計(jì)算ΔA=A1-A2=1.1227-0.9854=0.1373，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：C4H酶活（U/g質(zhì)量）=535.91×ΔA÷W=535.91×0.1373÷0.1=735.80 U/g 質(zhì)量。

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