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專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC5890-50T/24S
更新時間：2024-04-15
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：906
010-50973130
產品分類
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蛋白質游離巰基含量檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
貨號：BC5890
規格：50T/24S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液一 | 液體25 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液二 | 液體25 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 液體20 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 液體17 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑四 | 液體2 mL×1支 | 2-8℃保存 |
標準品 | 粉劑×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 提取液配制：臨用前根據樣本量按照提取液一：提取液二=1mL：1 mL進行配制，請勿一次性全部混合。
2、 若試劑二有析出，可置于37℃水浴加熱至澄清透明后使用。
3、 標準品：10mg還原型谷*甘肽（GSH）。臨用前加入1.3mL蒸餾水配制成25μmol/mL，2-8℃保存4周。
4、 0.125μmol/mL標準品配制：取50μL 25μmol/mL標準品，加入950μL蒸餾水，充分混勻，配制成1.25μmol/mL的標準品；然后取100μL 1.25μmol/mL標準品，加入900μL蒸餾水，充分混勻，配制成0.125μmol/mL的標準品備用，現配現用。
產品說明：
巰基的存在使得蛋白質能夠進行二硫鍵的形成，從而維持分子的穩定性和功能性。此外，巰基還參與到氧化還原反應中，具有重要的生物學作用。在細胞內，巰基含量的變化與多種疾病的發生和進展密切相關，因此巰基也成為了生物醫學領域中的重要研究對象。本試劑盒測定的是蛋白質中的游離巰基含量。
一定條件下巰基會發生親核反應，即巰基與5,5’-二硫代-雙-硝基苯甲酸（DTNB）反應，生成黃色化合物，在412nm處有最大吸收峰，據此可以計算蛋白質游離巰基含量。
-SH +DTNB TNB（412nm）
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、1mL玻璃比色皿、低溫離心機、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、丙酮（AR）、蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1. 組織：按照質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，3000rpm 離心10min，棄上清。在沉淀中加入2mL試劑一，攪勻后溶解沉淀，沉淀溶解液作為樣本進行實驗。（注：（1）植物葉片等纖維含量較高的樣本，溶解沉淀后4℃ 3000rpm離心3min，取上清作為樣本進行實驗,；（2）加入試劑一后會有大量氣泡產生，請緩慢加入，建議使用5mL的EP管）。
2. 細菌/細胞：按照細菌/細胞數量（106個）：提取液體積（mL）為5~10：1的比例（建議5百萬細菌/細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎（功率200W，超聲3秒，間隔10秒，總時間3min）后，于4℃，3000rpm 離心10min，棄上清。在沉淀中加入2mL試劑一，攪勻后溶解沉淀，沉淀溶解液作為樣本進行實驗。（注：（1）若沉淀溶解不全，可4℃ 3000rpm離心3min，取上清作為樣本進行實驗；（2）加入試劑一后會有大量氣泡產生，請緩慢加入，建議使用5mL的EP管）。
3. 血清/血漿、牛奶等液體：取100μL液體樣本加入0.9mL丙酮，4℃，3000rpm 離心10min，棄上清。在沉淀中加入2mL試劑一，攪勻后溶解沉淀，沉淀溶解液作為樣本進行實驗。（注：若測定數值偏小，可改變樣本與丙酮的比例，如取0.2mL液體樣本加入0.8mL丙酮或0.3mL液體樣本加入0.7mL丙酮，注意同步修改計算公式）。
二、測定步驟
1、 可見分光光度計預熱30min以上，調節波長至412nm，蒸餾水調零。
2、 操作表：（建議在5mL的EP管中操作）
試劑名稱（mL） | 對照管 | 測定管 | 空白管 | 標準管 | |
樣本 | 0.5 | 0.5 | - | - | |
蒸餾水 | - | - | 0.5 | - | |
標準品 | - | - | - | 0.5 | |
提取液 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | |
請緩慢加入提取液混勻，并用吸頭反復吹打至氣泡不再產生（期間會有大量氣泡產生，開蓋放置） | - | - | |||
試劑二 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | |
充分混勻，4℃ 3000 rpm離心10min后取上清于1.5mL EP管中 | - | - | |||
上清液 | 0.7 | 0.7 | 0.7 | 0.7 | |
試劑三 | 0.3 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | |
試劑四 | - | 0.05 | 0.05 | 0.05 | |
充分混勻，室溫靜置10min后，測定412nm下的吸光度分別記為A對照、A測定、A空白、A標準。計算ΔA測定=A測定-A對照，ΔA標準=A標準-A空白。空白管和標準管只需測1-2次。每個測定管需設一個對照管。 | |||||
三、蛋白質游離巰基含量的計算
1. 按照樣本蛋白濃度計算
蛋白質游離巰基含量（μmol/mg prot）=ΔA測定÷（ΔA標準÷C標準）×V樣本÷（V樣本×Cpr）×F
=0.125× ΔA測定÷ΔA標準×Cpr×F
2. 按照樣本質量計算
蛋白質游離巰基含量（μmol/g 質量）=ΔA測定÷（ΔA標準÷C標準）×V試劑一÷W×F
=0.25×ΔA測定÷ΔA標準÷W×F
3. 按照液體體積計算
蛋白質游離巰基含量（μmol/mL）=ΔA測定÷（ΔA標準÷C標準）×V試劑一÷V液樣×F
=2.5×ΔA測定÷ΔA標準×F
4. 按照細胞/細菌數量計算：
蛋白質游離巰基含量（μmol/106 cell）= ΔA測定÷（ΔA標準÷C標準）×V試劑一÷N×F
= 0.25×ΔA測定÷ΔA標準÷N×F
C標準：標準管濃度，0.125μmol/mL；V樣本：加入的樣本體積，0.5mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL，蛋白濃度需自行測定；W：樣本質量，g；V試劑一：提取時加入試劑一體積，2mL；V液樣：提取時加入的樣本體積，0.1mL；F：稀釋倍數。N：細胞/細菌總數，以106計。
注意事項：
1. 若樣本ΔA測定<0.01，可適當增大樣本量后測定，注意同步修改空白管和標準管及計算公式；若樣本ΔA測定>1.5，可用試劑一稀釋沉淀溶解液后測定，注意同步修改計算公式中的稀釋倍數。
2. 可使用BCA法測定蛋白濃度。
實驗實例：
1、 取100μL馬血清，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得ΔA測定=A測定-A對照=0.110-0.021=0.089，ΔA標準=A標準-A空白=0.633-0.076=0.557，按樣本液體體積計算蛋白質游離巰基含量得：
蛋白質游離巰基含量（μmol/mL）=2.5×ΔA測定÷ΔA標準×F =0.399μmol/mL。
2、 取0.1036g鼠肝，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得ΔA測定=A測定-A對照=0.339-0.095=0.244，ΔA標準=A標準-A空白=0.633-0.076=0.557，按樣本質量計算蛋白質游離巰基含量得：
蛋白質游離巰基含量（μmol/g 質量）=0.25×ΔA測定÷ΔA標準÷W×F =1.057μmol/g 質量。
3、 取0.1078g黃豆粉，沉淀溶解液用試劑一稀釋2倍后，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得ΔA測定=A測定-A對照=0.108-0.033=0.075，ΔA標準=A標準-A空白=0.633-0.076=0.557，按樣本質量計算蛋白質游離巰基含量得：
蛋白質游離巰基含量（μmol/g 質量）=0.25×ΔA測定÷ΔA標準÷W×F =0.625μmol/g 質量。
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