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專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC4320-50T/24S
更新時間：2024-04-16
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：1221
010-50973130
產品分類
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細胞壁結合酸性轉化酶（CWI）活性檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
貨號：BC4320
規格：50T/24S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液一 | 液體30 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液二 | 液體50 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 粉劑×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 液體35 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
標準品 | 粉劑×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 試劑二：臨用前加入25 mL試劑一，充分溶解后待用；
2、 標準品：10 mg無水*萄糖。臨用前加入1 mL 蒸餾水充分溶解，配成10 mg/mL葡萄糖溶液備用，2-8℃保存一周。
產品說明：
蔗糖轉化酶（Invertase，Inv）不可逆的催化蔗糖裂解形成葡萄糖和果糖，在植物蔗糖代謝中發揮著重要作用。Inv根據最適pH，可分為酸性轉化酶（AI）和中性轉化酶（NI），其中AI根據亞細胞定位的差異又可分為可溶性酸性轉化酶（Soluble acid Invertase，SAI）和細胞壁結合酸性轉化酶（Cell wall-bound acid Invertase，CWI）。 CWI以離子鍵的形式結合在細胞壁上，在“庫"組織韌皮部蔗糖卸載、蔗糖質外運輸、植物的生長發育以及抵抗各種脅迫中起著重要作用。
CWI催化蔗糖降解產生還原糖，還原糖與3,5 –二硝基水楊酸反應生成在540nm有特征吸收峰的棕紅色物質，通過測定540nm處吸光值變化可計算得CWI活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、臺式低溫離心機、水浴鍋、1mL玻璃比色皿、可調式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
組織：按照質量（g）: 提取液一體積（mL）為1 : 5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，12000g，離心10min，棄上清，留沉淀；沉淀中加入1mL蒸餾水，充分震蕩混勻，4℃，12000g，離心10min，棄上清，留沉淀；沉淀中加入1mL提取液二，充分混勻，4℃浸提15 h，4℃，12000g，離心10min，取上清置于冰上待測。
二、測定步驟
1、 分光光度計預熱30min以上，調節波長至540nm，蒸餾水調零。
2、 將10mg/mL標準液用蒸餾水稀釋為1、0.8、0.6、0.5、0.4、0.3mg/mL的標準溶液備用。
3、 操作表 (在2mL離心管中操作) ：
試劑名稱（µL） | 對照管 | 測定管 | 標準管 | 空白管 |
樣本 | 200 | 200 | - | - |
標準溶液 | - | - | 200 | - |
蒸餾水 | - | - | - | 200 |
試劑一 | 800 | 800 | 800 | |
試劑二 | - | 800 | - | - |
混勻，37℃水浴30min后，95℃水浴10 min（蓋緊，防止水分散失）。 | - | |||
試劑三 | 500 | 500 | 500 | 500 |
混勻，95℃水浴5 min（蓋緊，防止水分散失），冷卻至室溫。 | ||||
混勻，取1000 µL置于1 mL玻璃比色皿中，測定540nm處吸光值A，分別記為A對照管，A測定管，A標準管，A空白管。計算ΔA=A測定管-A對照管，ΔA標準=A標準管-A空白管。每個測定管需設一個對照管（標準曲線只需檢測1-2次)。 | ||||
注意：如果樣本在37℃反應后的95℃水浴步驟中出現沉淀，建議室溫12000g，離心5min，取上清（若上清不足1000µL，可按比例縮小加樣體系，如800µL上清+400µL試劑三）進行下一步操作。
三、CWI活性計算
1、 標準曲線的繪制：
以各個標準溶液的濃度為x軸，其對應的ΔA標準為y軸，繪制標準曲線，得到標準方程y=kx+b，將ΔA帶入方程得到x（mg/mL）。
2、 CWI活性的計算：
（1）按樣本蛋白濃度計算
酶活定義：37℃每mg蛋白每分鐘分解蔗糖產生1µg還原糖為1個酶活力單位。
CWI酶活（U/mg prot）= x×V提取÷（V提取×Cpr）×103÷T = 33.33x÷Cpr
（2）按樣本質量計算
酶活定義：37℃每g樣本每分鐘分解蔗糖產生1µg還原糖為1個酶活力單位。
CWI酶活（U/g質量）= x×V提取×103÷W÷T = 33.33x÷W
V提取：提取液體積，1mL；103：單位換算系數，1mg=103µg；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測定；W：樣本質量，g；T：反應時間，30min。
注意事項：
1. 當A或ΔA超過1時，建議將樣本用提取液二稀釋后再進行測定，計算公式中乘以稀釋倍數。
2. 95℃水浴時EP管蓋緊，防止水分散失，待冷卻至室溫后（建議每次實驗后冷卻時間保持一致），再進行下一步操作，避免液體飛濺燙傷以及影響試驗數據。
實驗實例：
1. 取0.1g丁香葉加入1mL提取液進行勻漿研磨，最后取上清后按照操作步驟操作，測A對照管=0.566，A測定管=0.903，標準曲線y=1.315x-0.2723，A空白管=0.058，計算ΔA=A測定管-A對照管=0.903-0.566=0.337，x=（0.337+0.2723）÷1.315=0.463，按樣本質量計算酶活得：
CWI酶活（U/g質量）= 33.33x÷W= 33.33×0.463÷0.1=154.433 U/g質量。
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