線粒體呼吸鏈復合體Ⅲ/CoQ-細*色素C還原酶活性檢測試劑盒說明書
微量法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC3245
規格：100T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 工作液的配制：臨用前取1支試劑二轉移到1瓶試劑一中混合溶解（約62T），用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復凍融。

產品說明：
線粒體復合體Ⅲ（EC 1.10.2.2）又稱CoQ-細*色素C還原酶，廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞的線粒體中，是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分，負責把還原型CoQ的氫傳遞給細*色素C，生成還原型細*色素C。
與氧化型細*色素C不同，還原型細*色素C在550nm有特征光吸收，因此550nm光吸收增加速率能夠反映線粒體復合體Ⅲ酶活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
實驗中所需儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板（非聚苯乙烯材質）、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見“產品資料"附件
注意事項：

1. 盡量保持比色皿內反應液溫度在37℃或25℃。可以在記錄初始吸光度A1后迅速將比色皿連同反應液一起放入37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴中準確反應2分鐘，之后迅速取出比色皿并擦干，記錄2min時的吸光度。

2. 當測定吸光值大于1時，建議將樣本用提取液稀釋后測定，計算公式中注意乘以稀釋倍數。

3. 此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

4. 由于提取液中含有一定濃度的蛋白（約1mg/mL），所以在測定樣本蛋白濃度時需要減去提取液本身的蛋白含量(單獨測定)。

5. 推薦使用樣本蛋白濃度計算酶活，若用樣本質量計算，則需加測胞漿提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方為總酶活。

6. 本試劑盒試劑足夠完成100管反應。

7. 附:使用樣本重量計算公式：（樣本檢測數為100T/24S）

A、上清中復合體Ⅲ活力的計算:
單位的定義：每g組織每分鐘催化產生1nmol還原型細*色素C定義為一個酶活力單位。
復合體Ⅲ活力(U/g 質量)=[ΔA1×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V樣)÷T=262×ΔA1÷W
ΔA1：上清測定值；V反總：反應體系總體積，2×10^-4L；ε：細*色素C摩爾消光系數，1.91×10⁴L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V提取：加入提取液體積，1.0mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，2min；10⁹：單位換算系數，1mol=10⁹nmol。
B、沉淀中復合體Ⅲ活力的計算:
單位的定義：每g組織每分鐘催化產生1nmol還原型細*色素C定義為一個酶活力單位。
復合體Ⅲ活力(U/g 質量)=[ΔA2×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V樣)÷T=52×ΔA2÷W
ΔA2：沉淀測定值；V反總：反應體系總體積，2×10^-4L；ε：細*色素C摩爾消光系數，1.91×10⁴L/mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V提?。杭尤胩崛∫后w積，0.2mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，2min；10⁹：單位換算系數，1mol=10⁹nmol。
C、樣本復合體Ⅲ總活力的計算:
樣本復合體Ⅲ總活力即為上清中復合體Ⅲ活力與沉淀中復合體Ⅲ活力之和。
復合體Ⅲ（U/g 質量）=262×ΔA1÷W +52×ΔA2÷W
D、以96孔板計算：
將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm進行計算即可。
實驗實例：

1. 取0.1g兔子腎臟進行樣本處理，將復溶后的沉淀稀釋2倍后按照測定步驟操作，使用微量玻璃比色皿測得計算ΔA=（A2測定-A1測定）-（A2對照-A1對照）=（0.9921-0.9077）-（0.9664-0.9419）=0.0599，按樣本蛋白濃度計算得：

復合體Ⅲ（U/mg prot）=262×ΔA÷Cpr×2（稀釋倍數）=262×0.0599÷2.56×2（稀釋倍數）=12.26 U/mg prot。
相關發表文獻：

1. Ming Song,Fangfang Chen,Yihui Li,et al. Trimetazidine restores the positive adaptation to exercise training by mitigating statin-induced skeletal muscle injury. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. November 2017;(IF10.754)

2. Liuqin He,Haiwen Zhang,Xihong Zhou. Weanling Offspring of Dams Maintained on Serine-Deficient Diet Are Vulnerable to Oxidative Stress. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. September 2018;(IF4.868)

3. Qiuli OuYang,Nengguo Tao,Miaoling Zhang. A Damaged Oxidative Phosphorylation Mechanism Is Involved in the Antifungal Activity of Citral against Penicillium digitatum. Frontier in Immunology. February 2018;(IF4.259)

4. Wang M, Zhang Y, Xu M, et al. Roles of TRPA1 and TRPV1 in cigarette smoke-induced airway epithelial cell injury model[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2019, 134: 229-238.

5. Bao Z, Xu X, Chao H, et al. ERK/Nrf2/HO-1 pathway-mediated mitophagy alleviates traumatic brain injury-induced intestinal mucosa damage and epithelial barrier dysfunction[J]. 2017.

參考文獻：

1. Luo C, Long J, Liu J. An improved spectrophotometric method for a more specific and accurate assay of mitochondrial complex III activity[J]. Clinica Chimica Acta, 2008, 395(1-2): 38-41.

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