谷*甘肽還原酶（GR）活性檢測試劑盒說明書
微量法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC1165
規(guī)格：100T/96S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前加入1.5mL蒸餾水溶解備用，2-8℃可保存4周；

2. 試劑三：試劑存于試劑瓶內玻璃瓶中；臨用前加入3 mL蒸餾水溶解備用，-20℃可分裝保存4周，避免反復凍融。

產品說明：
GR（EC1.8.1.7，Glutathione Reductase，GR）是廣泛存在于真核和原核生物中的一種黃素蛋白氧化還原酶，GR是 谷*甘肽氧化還原循環(huán)的關鍵酶之一（通常昆蟲中GR被TrxR取代）。GR催化NADPH還原*生成GSH，有助于維持體內GSH/*比值。GR在氧化脅迫反應中對活性氧清除起關鍵作用，此外GR還參與抗壞血酸－ 谷*甘肽循環(huán)途徑。
GR能催化NADPH還原*再生GSH，同時NADPH脫氫生成NADP⁺；NADPH在340nm有特征吸收峰，相反NADP⁺在該波長無吸收峰；通過測定340nm吸光度下降速率來測定NADPH脫氫速率，從而計算GR活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計/酶標儀、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、移液器、勻漿器/研缽/細胞超聲破碎儀、微量石英比色皿/96孔UV板、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。10000rpm，4℃離心10min，取上清置冰上待檢測。

2. 細菌、細胞：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3s，間隔7s，總時間3min），然后10000rpm，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

3. 血清（血漿）等液體：直接測定。

二、測定步驟

1. 分光光度計或酶標儀預熱30 min以上，調節(jié)波長到340nm，蒸餾水調零。

2. 根據(jù)樣本量取部分試劑一置于37℃中預熱15min以上。

3. 操作表：（在微量石英比色皿或96孔UV板中加入下列試劑）

三、GR活性計算
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
（1）按樣本蛋白濃度計算
活性單位定義：在37℃，pH 8.0條件下，每毫克蛋白每分鐘催化1μmol NADPH氧化為一個酶活力單位。
GR酶活(U/mg prot)= [ (ΔA測定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反總×10⁶] ÷（Cpr×V樣）÷T
=0.536×(ΔA測定管-ΔA空白管)÷Cpr
（2）按樣本質量計算
活性單位定義：在37℃，pH 8.0條件下，每克樣本每分鐘催化1μmol NADPH氧化為一個酶活力單位。
GR酶活(U/g 質量)= [ (ΔA測定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反總×10⁶] ÷(V樣÷V樣總×W)÷T
=0.536×(ΔA測定管-ΔA空白管)÷W
（3）按細胞數(shù)量計算
活性單位定義：在37℃，pH 8.0條件下，每10⁴個細胞每分鐘催化1μmol NADPH氧化為一個酶活單位。
GST活性（U/10⁴ cell）=[ (ΔA測定管-ΔA空白管)÷（ε×d）×10⁶×V反總]÷(N×V樣÷V樣總)÷T
    =0.536×(ΔA測定管-ΔA空白管)÷N
（4）按液體體積計算
活性單位定義：在37℃，pH 8.0條件下，每毫升液體每分鐘催化1μmol NADPH氧化為一個酶活單位。
GST活性（U/mL）= [(ΔA測定管-ΔA空白管)÷（ε×d）×10⁶×V反總]÷V樣÷T
= 0.536×(ΔA測定管-ΔA空白管)
ε：NADPH摩爾消光系數(shù)6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應體系總體積，200μL=2×10^-4L；10⁶：單位換算系數(shù)，1mol=1×10⁶μmol；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；V樣：加入反應體系中的樣本體積，20μL=2×10^-2mL；V樣總：樣本總體積，1mL；T：反應時間，3min；N：細胞數(shù)量，以萬計。
b.使用96孔板測定的計算公式如下
（1）按蛋白濃度計算
活性單位定義：在37℃、pH 8.0條件下，每毫克蛋白每分鐘催化1μmol NADPH氧化為一個酶活力單位。
GR酶活(U/mg prot)=[ (ΔA測定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反總×10⁶]÷（Cpr×V樣）÷T
   =0.893×(ΔA測定管-ΔA空白管)÷Cpr

（2）按樣本質量計算
活性單位定義：在37℃、pH 8.0條件下，每克樣本每分鐘催化1μmol NADPH氧化為一個酶活力單位。
GR酶活(U/g質量)=[(ΔA測定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反總×10⁶]÷(V樣÷V樣總×W)÷T
          =0.893×(ΔA測定管-ΔA空白管)÷W
（3）按細胞數(shù)量計算：
活性單位定義：在37℃、pH 8.0條件下，每10⁴個細胞每分鐘催化1μmol NADPH氧化為一個酶活單位。
GST活性（U/10⁴ cell）=[ (ΔA測定管-ΔA空白管)÷（ε×d）×10⁶×V反總]÷(N×V樣÷V樣總)÷T
    =0.893×(ΔA測定管-ΔA空白管)÷N
（4）按液體體積計算
活性單位定義：在37℃、pH 8.0條件下，每毫升液體每分鐘催化1μmol NADPH氧化為一個酶活單位。
GST活性（U/mL）= [(ΔA測定管-ΔA空白管)÷（ε×d）×10⁶×V反總]÷V樣÷T
= 0.893×(ΔA測定管-ΔA空白管)
ε：NADPH摩爾消光系數(shù)6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.6cm；V反總：反應體系總體積，200μL=2×10^-4L；10⁶：單位換算系數(shù)，1mol=1×10⁶μmol；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；V樣：加入反應體系中的樣本體積，20μL =2×10^-2mL；V樣總：樣本總體積，1mL；T：反應時間，3min；N：細胞數(shù)量，以萬計。
注意事項：

1. 樣本處理等過程均需要在冰上進行，且須在當日測定酶活力，勻漿液避免反復凍融；

2. 測定前須先用1-2個樣做預實驗，哺乳動物組織一般須用試劑一稀釋2-5倍；

3. 由于試劑一中含有一定濃度的蛋白（約0.1mg/mL），所以在測定樣本蛋白濃度時需要減去試劑一本身的蛋白含量。

實驗實例：

1. 取0.1g桃樹葉片加入1.0 mL試劑一，冰上充分研磨，10000rpm 4℃離心10min，取上清液稀釋4倍后按測定步驟檢測，用微量石英比色皿測得ΔA測定管=A測1-A測2=1.0765-0.626=0.4505，ΔA空白管=A空1-A空2=0，按樣本質量計算酶活得：

GR酶活(U/g 質量)=0.536×(ΔA測定管-ΔA空白管)÷W×4（稀釋倍數(shù)）=9.66 U/g 質量。

1. 取0.1g大鼠肝臟組織加入1.0 mL試劑一，冰上充分研磨，10000rpm 4℃離心10min，取上清液稀釋8倍后按測定步驟檢測，用微量石英比色皿測得ΔA測定管=A測1-A測2=0.9916-0.5632=0.4284，ΔA空白管=A空1-A空2=0，按樣本質量計算酶活得：

GR酶活(U/g 質量)=0.536×(ΔA測定管-ΔA空白管)÷W×8（稀釋倍數(shù)）=18.37 U/g 質量。
相關發(fā)表文獻：

1. Hua Li,Lanying Wang,Yanping Luo. Composition Analysis by UPLC-PDA-ESI (?)-HRMS and Antioxidant Activity Using Saccharomyces cerevisiae Model of Herbal Teas and Green Teas from Hainan. Molecules. October 2018;(IF3.06)

2. Zeyong Zhang,Huanhuan Liu,Ce Sun,et al. A C2H2 zinc-finger protein OsZFP213 interacts with OsMAPK3 to enhance salt tolerance in rice. Journal of Plant Physiology.October 2018;(IF2.825)

3. Li S, Tian Y, Wu K, et al. Modulating plant growth–metabolism coordination for sustainable agriculture[J]. Nature, 2018, 560(7720)：595-600.

參考文獻：

1. Demiral T, Türkan I. Comparative lipid peroxidation, antioxidant defense systems and proline content in roots of two rice culti vars differing in salt tolerance[J]. Environmental and experimental botany, 2005, 53(3): 247-257.

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