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專注于生物學試劑及試劑盒領域
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產品型號：BC1070-50T/48S
更新時間：2024-04-15
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：1646
010-50973130
產品分類
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丙酮酸脫羧酶（PDC）活性檢測試劑盒說明書
紫外分光光度法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC1070
規格：50T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
規格 | 保存條件 | |
提取液 | 液體60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一A | 液體28 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一B | 粉劑×1支 | -20℃保存 |
試劑一C | 液體2mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二A | 液體7 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二B | 粉劑×1支 | -20℃保存 |
試劑二C | 粉劑×1支 | |
試劑三 | 液體20 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 提取液：內含不溶物，使用前搖勻。
2、 試劑一的配制：臨用前配制，將試劑一B、試劑一C加入到試劑一A中并充分溶解。-20℃分裝保存，可保存4周，避免反復凍融。
3、 試劑二B：臨用前加入0.6mL蒸餾水溶解，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融。
4、 試劑二C：臨用前加入1mL蒸餾水溶解，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融。
5、 試劑二的配制：臨用前配制，取2.625mL試劑二A、0.225mL試劑二B、0.15mL試劑二C混合（共3mL，約30T），現用現配。
產品說明：
PDC主要存在于酵母中，是乙醇發酵的關鍵酶之一，催化丙酮酸脫羧生成乙醛。
PDC催化丙酮酸脫羧生成乙醛，添加乙醇脫氫酶（ADH）來進一步催化 NADH還原乙醛生成乙醇和NAD+；NADH在340nm有吸收峰，而NAD+沒有；通過測定340nm光吸收下降速率，來計算PDC活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品
臺式離心機、紫外分光光度計、水浴鍋/恒溫培養箱、1mL石英比色皿、可調式移液槍、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1、細胞或細菌樣本的制備：先收集細胞或細菌樣本到離心管內，棄上清，按照每500萬細胞或細菌加入1mL提取液，超聲波破碎細菌或細胞（功率200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）。16000g，4℃離心20min，取上清，置冰上待測。
2、組織樣本：稱取約0.1g組織，加入1mL提取液，冰上充分研磨。16000g，4℃離心20min，取上清，置冰上待測。
3、血清（漿）樣本：直接檢測。
二、測定步驟
1、 紫外分光光度計預熱30min以上，調節波長至340nm，蒸餾水調零。
2、 根據樣本數取適量試劑一、試劑三37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）水浴提前預熱30min。
3、 操作表：
試劑名稱（μL） | 測定管 | 空白管 |
試劑一 | 500 | 500 |
試劑三 | 300 | 300 |
試劑二 | 100 | 100 |
樣本 | 100 | - |
蒸餾水 | - | 100 |
在比色皿中加入上述試劑后迅速混勻后于340nm比色，記錄10s和70s的吸光值，測定管的記為A1和A2，空白管的記為A3和A4，計算ΔA=（A1-A2）-（A3-A4）。（空白管只需做1-2次）
三、PDC活性計算
1、血清（漿）PDC活力的計算：
單位的定義：37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）中，每毫升血清（漿）在反應體系中每分鐘催化1μmol NADH氧化定義為一個酶活力單位。
PDC（U/mL）=ΔA×V反總÷(ε×d)×106÷V樣本÷T=1.6×ΔA
2、 按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）中，每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘催化1μmol NADH氧化定義為一個酶活力單位。
PDC（U/mg prot）=ΔA×V反總÷(ε×d)×106÷(V樣本×Cpr)÷T=1.6×ΔA÷Cpr
3、按樣本質量計算：
單位的定義：37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）中，每g組織質量在反應體系中每分鐘催化1μmol NADH氧化定義為一個酶活力單位。
PDC（U/g 質量）=ΔA×V反總÷(ε×d)×106÷ (W÷V提取×V樣本)÷T=1.6×ΔA÷W
4、細菌或細胞中PDC活力的計算：
單位的定義：37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）中，每1萬個細菌或細胞在反應體系中每分鐘催化1μmol的NADH氧化定義為一個酶活力單位。
PDC（U/104 cell）=ΔA×V反總÷(ε×d)×106÷(V樣本÷V提取×N)÷T=1.6×ΔA÷N
ε：NADH摩爾消光系數，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應體系總體積，1mL=0.001L；V樣本：加入反應體系中上清液體積，0.1mL；Cpr：蛋白濃度（mg/mL），需要另外測定；T：反應時間，1min；W：樣本質量，g；V提取：提取液體積，1mL；106：單位換算系數，1mol=106μmol；N：細胞或細胞數量，以萬計。
注意事項：
1、 實驗時，試劑二和樣本在冰上放置，以免變性和失活。
2、 比色皿中反應液的溫度必須保持37℃或25℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃或25℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃或25℃水浴鍋中。在反應過程中把比色皿連同反應液放在此燒杯中。
3、 最好兩個人同時做此實驗，一個人比色，一個人計時，以保證實驗結果的準確性。
4、 如果1分鐘變化值較小可延長反應時間，同時注意修改計算公式。
實驗實例：
1、 取0.1g綠蘿葉加入1mL提取液進行勻漿研磨，取上清，之后按照測定步驟操作，用1mL石英比色皿測得計算ΔA=（A1-A2）-（A3-A4）=（0.945-0.93）-（0.716-0.714）=0.013，按樣本質量計算酶活得：
PDC（U/g 質量）=1.6×ΔA÷W=1.6×0.013÷0.1=0.208 U/g 質量。
2、 取0.1g小鼠肝臟加入1mL提取液進行勻漿研磨，取上清用蒸餾水稀釋40倍后按照測定步驟操作，用1mL石英比色皿測得計算ΔA=（A1-A2）-（A3-A4）=（0.602-0.322）-（0.716-0.714）=0.278，按樣本質量計算酶活得：
PDC（U/g 質量）=1.6×ΔA÷W=1.6×0.278÷0.1×40（稀釋倍數）=177.92 U/g 質量。
相關發表文獻：
Chong Li, Shi Gao, Xiaotong Li, et al. Efficient metabolic evolution of engineered Yarrowia lipolytica for succinic acid production using a glucose-based medium in an in situ fibrous bioreactor under low-pH condition. Biotechnology for Biofuels. August 2018; (IF5.452)
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