高鐵螯合物還原酶（FCR）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

貨號(hào)：BC5915

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 顯色液：臨用前根據(jù)樣本數(shù)量按照試劑一：試劑二：試劑三=50μL：50μL：50μL（150μL，1T）的比例配制顯色液，充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2、 標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入0.71mL蒸餾水和10μL濃硫酸，配制成50μmol/mL Fe²⁺標(biāo)準(zhǔn)液。溶解好的標(biāo)準(zhǔn)品2-8℃可以保存2周。

3、 62.5nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：臨用前取50μL 50μmol/mL Fe²⁺標(biāo)準(zhǔn)液和950μL蒸餾水混合配制成2.5μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液；再吸取25μL 2.5μmol/mL（2500nmol/mL）和975μL蒸餾水混合配制成62.5nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

產(chǎn)品說(shuō)明：

雙子葉植物和非禾本科單子葉植物采用鐵螯合還原反應(yīng)的高效活化和吸收機(jī)制從土壤中獲取鐵。三價(jià)鐵還原為二價(jià)鐵后才能被植物吸收利用。在鐵充足時(shí)，植物根部的三價(jià)鐵氧化還原酶將Fe(III)-螯合物中的鐵還原并將還原所得Fe²⁺轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)入根細(xì)胞內(nèi)。高鐵螯合物還原酶（Ferric chelate reductase，FCR，EC1.16.1.7）催化Fe³⁺還原為Fe²⁺，F(xiàn)e²⁺和菲洛嗪形成紫色絡(luò)合物，在562nm下有特征吸收峰。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、分析天平、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、濃硫酸（95%-99% AR）、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織樣本：按質(zhì)量（g）: 提取液體積（mL）1 : 5~10比例加入提取液（建議稱(chēng)取0.1g樣本，加入1.0mL提取液），冰浴勻漿后，于4℃，8000g，離心10min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測(cè)。

2. 液體樣本：直接測(cè)定。若液體有渾濁則離心取上清測(cè)定。

二、測(cè)定步驟

1．可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至562nm，可見(jiàn)分光光度計(jì)用蒸餾水調(diào)零。

2．顯色液臨用前平衡至常溫。

3．標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定

吸取50μL 62.5nmol/mL Fe²⁺標(biāo)準(zhǔn)液，加入150μL顯色劑，充分混勻，測(cè)定562nm下的吸光度，記為A標(biāo)準(zhǔn)，此時(shí)Fe²⁺終濃度為15.625nmol/mL，標(biāo)準(zhǔn)管只需做1-2次。

4．空白管測(cè)定

吸取50μL蒸餾水，加入150μL顯色劑，充分混勻，測(cè)定562nm下的吸光度，記為A空白，計(jì)算ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白，空白管只需做1-2次。

5．操作表：（在微量玻璃比色皿或96孔板中以下試劑）

三、高鐵螯合物還原酶（FCR）活性計(jì)算

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白在每mL體系中每分鐘生成1nmol Fe²⁺定義為一個(gè)酶活力單位。

FCR活性(U/mg prot)= ΔA×C標(biāo)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V總÷(Cpr×V樣) ÷T=2.083×ΔA÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算：

單位的定義：每g組織在每mL體系中每分鐘生成1nmol Fe²⁺定義為一個(gè)酶活力單位。

FCR活性(U/g 質(zhì)量) =ΔA×C標(biāo)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V反總÷(W÷V提取×V樣) ÷T =2.083×ΔA÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W

C標(biāo)：Fe²⁺標(biāo)準(zhǔn)液最終濃度，15.625nmol/mL；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，50μL=0.05mL；V提取：加入提取液體積，1mL； T：反應(yīng)時(shí)間，30min；W：樣本質(zhì)量，g。

注意事項(xiàng)：

1、 如果?A小于0.010或測(cè)定管吸光值接近空白管，可以增加樣本量或者延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間后再進(jìn)行測(cè)定；如果?A大于1或者A1大于1，建議將樣本上清用提取液適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。注意同步修改計(jì)算公式。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 稱(chēng)取0.1214g櫻桃番茄，加入提取液進(jìn)行冰浴勻漿，按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得計(jì)算ΔA= A2-A1=0.665-0.127=0.538，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.525-0.083=0.442，帶入公式計(jì)算：

FCR活性(U/g 質(zhì)量) =2.083×ΔA÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W=20.885 U/g 質(zhì)量

2、 稱(chēng)取0.1002g閩南葉片，加入提取液進(jìn)行冰浴勻漿，按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得計(jì)算ΔA= A2-A1=0.188-0.104=0.084，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.525-0.083=0.442，帶入公式計(jì)算：

FCR活性(U/g 質(zhì)量) =2.083×ΔA÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W=3.951U/g 質(zhì)量

參考文獻(xiàn)：

[1] Shabnam N , Kim M , Kim H .Iron (Ⅲ) oxide nanoparticles alleviate arsenic induced stunting in Vigna radiata[J].Ecotoxicology and Environmental Safety, 2019, 183(Nov.).

[2 Kabir A H , Akther M S , Skalicky M ,et al.Downregulation of Zn-transporters along with Fe and redox imbalance causes growth and photosynthetic disturbance in Zn-deficient tomato[J].Scientific Reports, 2021, 11(1).

[3] Ojeda M , Schaffer B , Davies F S .Root and Leaf Ferric Chelate Reductase Activity in Pond Apple and

Soursop[J].Journal of Plant Nutrition, 2005, 27(8):1381-1393.

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