細(xì)胞銅（Cu）含量檢測(cè)試劑盒說明書

微量法

貨號(hào)：BC5755

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑一：若有試劑析出，置于37℃水浴溶解即可。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品：10mmol/L（即10000nmol/mL）硫酸銅標(biāo)準(zhǔn)液。

3. 20nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品配制：將10000nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水先稀釋為200nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再將200nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液稀釋為20nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)液備用，具體稀釋可參考以下：取20µL 10000nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)液加入980µL蒸餾水混勻，即為200nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)品；再吸取100µL 200nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)液加入900µL蒸餾水混勻，即為20nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)品。

產(chǎn)品說明：

銅（Cu）是人體必需的微量元素之一，也是蛋白質(zhì)以及酶的重要組成部分。可以存在于紅細(xì)胞的內(nèi)外，主要功能是輔助造血，即催化血紅蛋白的合成。銅元素可以適當(dāng)促進(jìn)人體的骨骼發(fā)育，促進(jìn)人體神經(jīng)系統(tǒng)以及腦部發(fā)育，維持嬰幼兒的正常生長(zhǎng)發(fā)育，因此，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)銅離子含量可知體內(nèi)是否缺銅。

在酸性條件下，Cu²⁺從銅藍(lán)蛋白和清蛋白中解離出來，與絡(luò)合劑3,5-二溴-PAESA反應(yīng)，產(chǎn)生紫色絡(luò)合物，在580nm處有特征吸收峰，在一定范圍內(nèi)吸光度與濃度成正比，從而計(jì)算出Cu²⁺濃度。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

細(xì)胞的處理：收集細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)胞數(shù)量（10⁶個(gè)）：蒸餾水體積（mL）為5~10：0.4的比例（建議5百萬細(xì)胞加入0.4mL蒸餾水），超聲波破碎細(xì)胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔7s，共3min），然后10000g，4℃，離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

二、測(cè)定步驟

1、 可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至580nm，分光光度計(jì)用蒸餾水調(diào)零。

2、 實(shí)驗(yàn)前根據(jù)樣本量取部分試劑一37℃預(yù)熱10min。

3、 操作表：（在1.5mLEP管或96孔板中加入下列試劑）

三、細(xì)胞銅（Cu）含量的計(jì)算

按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

細(xì)胞銅（Cu）含量（nmol/10⁶ cell）= ΔA測(cè)定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V提取÷N =8×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷N

按蛋白濃度計(jì)算：

細(xì)胞銅（Cu）含量（nmol/mg prot）= ΔA測(cè)定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V提取÷（Cpr×V提取）

= 20×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr

C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，20nmol/mL；V提取：試劑一體積，0.4mL；N：細(xì)胞總數(shù)，以百萬計(jì)；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL。

注意事項(xiàng)：

1. 37℃孵育5min后請(qǐng)立即測(cè)定吸光度，若樣本數(shù)量過多，可分批次測(cè)定，盡量確保在20min內(nèi)完成測(cè)定。

2. 如果樣本測(cè)定吸光值大于0.5，建議將樣本用蒸餾水稀釋后進(jìn)行測(cè)定，注意同步修改計(jì)算公式。

3. 如果樣本測(cè)定吸光值小于0.005或接近空白管吸光值，可適當(dāng)增大樣本量，空白管和標(biāo)準(zhǔn)管也需要進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 收集約5百萬SHSY5Y細(xì)胞，加入0.4mL蒸餾水，超聲波破碎（功率 200w，超聲3s，間隔7s，共3min），10000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。之后按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A空白=0.152-0.092=0.060，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.334-0.092=0.242，按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算銅含量得：

細(xì)胞銅含量（nmol/10⁶ cell）=8×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷N =0.3967 nmol/10⁶ cell。

2. 收集約5百萬U937細(xì)胞，加入0.4mL蒸餾水，超聲波破碎（功率 200w，超聲3s，間隔7s，共3min），10000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。之后按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A空白=0.122-0.092=0.030，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.334-0.092=0.242，按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算銅含量得：

細(xì)胞銅含量（nmol/10⁶ cell）=8×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷N =0.1983 nmol/10⁶ cell。

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