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專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC5720-50T/24S
更新時間：2024-04-23
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：930
010-50973130
產品分類
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土壤酸性木聚糖酶（S-ACX）活性檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
貨號：BC5720
規格：50T/24S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
溶液的配制：
1、 標準品稀釋液的配制：臨用前按緩沖液：試劑一=4.8mL：2.4mL（7.2mL，約一條標曲稀釋用量）的比例進行配制，現配現用。
2、 標準品：10mg木糖。臨用前加入667μL標準品稀釋液配制成100μmol/mL的木糖標準液，2-8℃保存8周。
產品說明：
土壤酸性木聚糖酶（Soil acid xylanase, S-ACX），又稱為土壤酸性半纖維素酶，主要分離自最適生長pH為4-5的微生物。
在酸性環境中，S-ACX催化木聚糖降解成還原性寡糖和單糖，在沸水浴條件下進一步與3,5-二硝基水楊酸發生顯色反應，在540nm處有特征吸收峰，反應液顏色的深淺與酶解產生的還原糖量成正比，通過測定反應液在540nm吸光值增加速率，可計算S-ACX活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、1mL玻璃比色皿、天平、低溫離心機、水浴鍋、研缽、30~50目篩、蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
新鮮土樣自然風干或37℃烘箱風干，過30~50目篩。
二、測定步驟
1、 可見分光光度計預熱30min以上，調節波長至540nm，用蒸餾水調零。
2、 標準品的稀釋：臨用前將標準品用標準品稀釋液稀釋為1.5、1.2、1、0.8、0.6、0.4μmol/mL的標準溶液待測。
3、 標準品稀釋表：
稀釋前濃度（μmol/mL） | 標準品體積（μL） | 稀釋液體積（μL） | 稀釋后濃度（μmol/mL） | |
1 | 100 | 100 | 900 | 10 |
2 | 10 | 150 | 850 | 1.5 |
3 | 10 | 120 | 880 | 1.2 |
4 | 10 | 150 | 1350 | 1 |
5 | 1 | 400 | 100 | 0.8 |
6 | 1 | 300 | 200 | 0.6 |
7 | 1 | 200 | 300 | 0.4 |
備注：實驗中每管需要300μL。
4、 樣本測定（在EP管中加入下列試劑）
試劑名稱（μL） | 對照管 | 測定管 | 空白管 | 標準管 |
樣本 | 0.1g | 0.1g | - | - |
緩沖液 | 400 | 400 | - | - |
試劑一 | - | 200 | - | - |
渦旋混勻，置于50℃水浴鍋中反應2h，立即沸水浴中10min滅活。（注意不要讓蓋子爆開，以免進水，改變了反應體系），冷卻至室溫。 | - | - | ||
試劑一 | 200 | - | - | - |
常溫，12000g離心10min，取上清 | - | - | ||
上清液 | 300 | 300 | - | - |
標準品稀釋液 | - | - | 300 | |
標準品 | - | - | - | 300 |
試劑二 | 200 | 200 | 200 | 200 |
渦旋混勻，沸水浴中準確顯色5min（注意不要讓蓋子爆開，以免進水改變了反應體系），冷卻至室溫。 | ||||
蒸餾水 | 500 | 500 | 500 | 500 |
充分混勻后，室溫12000g離心5min，取上清液于1mL玻璃比色皿中測定540nm下的吸光度，分別記為A對照、A測定、A空白、A標準。計算ΔA測定=A測定-A對照，ΔA標準=A標準-A空白。空白管和標準曲線只需測1-2次。每個測定管需設一個對照管。 | ||||
三、S-ACX計算公式
1. 標準曲線的繪制：
根據標準管的濃度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA標準（y，ΔA標準），建立標準曲線。根據標準曲線，將ΔA測定（y，ΔA測定）帶入公式計算樣本濃度（x，μmol/mL）。
2. 土壤S-ACX活性計算：
酶活定義：50℃，pH 4.8條件下，每克土壤每小時分解木聚糖產生1μmol還原糖所需的酶量為一個酸性木聚糖酶的活性單位。
S-ACX活性（U/g 土樣）=x× V反總÷W÷T×F=0.3×x÷W×F
V反總：反應體系總體積，0.6mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，2h；F：稀釋倍數。
注意事項：
1. 若樣本ΔA<0.01，可適當增大樣本量或者延長50℃反應時間后測定；若樣本ΔA>1.5或者A測定＞1.5時，可用蒸餾水稀釋上清液后測定，注意同步修改計算公式中的稀釋倍數。
2. 建議使用螺旋管，防止沸水浴過程中蓋子爆開，改變反應體系。
實驗實例：
1、 取0.1g森林土樣，按操作表進行第一步反應2h后，取上清液用蒸餾水稀釋2倍后按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得ΔA測定=A測定-A對照=0.302-0.049=0.253，帶入標曲y=0.5374x-0.1048 （R2=0.9977），計算x=0.666，按樣本質量計算S-ACX活性得：
S-ACX活性（U/g 土樣）= 0.3×x÷W×F =3.996 U/g 土樣。
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