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專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC5660-50T/48S
更新時間：2024-04-23
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：1080
010-50973130
產品分類
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紫外分光光度法
貨號：BC5660
規格：50T/48S
產品內容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液 | 液體60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
粉劑一 | 粉劑×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體70 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 液體1.5 mL×1支 | -20℃保存 |
試劑三 | 粉劑×1瓶 | -20℃保存 |
試劑四 | 液體150 μL×1支 | 2-8℃保存 |
試劑五 | 液體60 μL×1支 | 2-8℃保存 |
試劑六 | 粉劑×1瓶 | -20℃保存 |
試劑七 | 粉劑×1瓶 | -20℃保存 |
1、 提取液：臨用前將粉劑一倒入提取液中，此溶液為懸濁液，使用前搖勻即可；
2、 試劑二工作液：臨用前根據樣本數量按照試劑一：試劑二= 855μL:45μL（900μL，2T）的比例配制，充分混勻，現配現用；
3、 試劑三：臨用前加入30 mL蒸餾水溶解，未用完的試劑分裝保存，-20℃保存可以保存4周，避免反復凍融；
4、 試劑六：臨用前加入10 mL蒸餾水溶解，未用完的試劑分裝保存，-20℃保存可以保存4周，避免反復凍融；
5、 試劑七：試劑放于試劑瓶內玻璃瓶中。臨用前加入9 mL蒸餾水溶解，未用完的試劑分裝保存，-20℃保存可以保存4周，避免反復凍融；
6、 工作液：臨用前根據樣本數量按照試劑一：試劑四：試劑五：試劑六：試劑七=1.4mL：5μL：2μL：0.3 mL：0.3 mL（2007μL，約2T）的比例配制，充分混勻，現配現用。（試劑四、試劑五使用前需先將液體離心至底部使用）
產品說明：
類黃酮糖基轉移酶（UDP-glycose flavonoid glycosyltransferase, UFGT）是莽草酸途徑的最后一個作用酶，也是使花色素形成穩定的花色苷的第一個作用酶，并使其由無色轉為有色；UFGT是果實著色過程中的關鍵酶，它使不穩定的花色素轉變為穩定的花色苷。
UFGT催化UDPG與槲皮素生成UDP和槲皮素糖苷；UDP在丙 酮酸激酶與乳酸脫氫酶作用下，氧化NADH為NAD+，NAD+生成速度與UDP含量成正比，通過340nm吸光度下降速度反映UFGT活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、分析天平、可調式移液器、1mL石英比色皿、研缽/勻漿器、蒸餾水和冰。
操作步驟：
一、 樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1、 組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
二、測定步驟
1、 紫外分光光度計預熱30min以上，調節波長至340nm，蒸餾水調零。
試劑名稱（μL） | 測定管 | 空白管 |
樣本 | 100 | - |
蒸餾水 | - | 100 |
試劑二工作液 | 450 | 450 |
試劑三 | 450 | 450 |
混勻，30℃反應4h，95℃水浴10 min滅活，冷卻至室溫。10000g 4℃離心5min，取上清液待測。（在此期間將工作液37℃預熱5min） | ||
上清液 | 100 | 100 |
工作液 | 900 | 900 |
將上清液和工作液分別加入1mL石英比色皿中，立即充分混勻后于340nm處測定10s時的吸光值A1，迅速置于37℃水浴鍋或者恒溫培養箱中反應2min，拿出迅速擦干測定2min10s時的吸光值A2，記錄 340nm 下10s時吸光值 A1 和 2min 后的吸光值 A2。計算A測定=A1測定-A2測定，A空白=A1空白-A2空白，?A =A測定-A空白。空白管只需做1-2次。 | ||
1、按照蛋白濃度計算
單位的定義：每mg組織蛋白每小時催化1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
UFGT活力(U/mg prot ) = ΔA×V反總II÷（ε×d）×109÷ （Cpr ×V樣÷V反總I×V上清）÷T×F
=4019.29×ΔA ÷Cpr×F
2、按樣本質量計算
單位的定義：每g組織每小時催化1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
UFGT活力(U/g 質量) = ΔA×V反總II÷（ε×d）×109÷（W× V樣÷V樣總÷V反總I×V上清）÷T×F
=4019.29×ΔA÷W×F
V反總I：30℃第一步反應體系總體積（V樣+ V試劑二工作液+V試劑三），1 mL；V反總II：37℃第二步反應體系總體積，1×10-3 L；ε：NADPH摩爾消光系數，6.22×103 L/mol/cm；d：石英比色皿光徑，1cm；V樣：加
入樣本體積，0.1mL；V上清：第二步反應中上清液體積，0.1 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，4h；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；F：稀釋倍數；109：換算系數，1mol=109nmol。
注意事項：
1、 如果A1測定＜A1空白或者ΔA大于0.5，可以對上清液進行稀釋或者縮短30℃反應時間重新測定；?A小于0.005，可以加大樣本量或者延長30℃反應反應時間重新測定。最終計算時同步修改計算公式。
實驗實例：
1、 稱取0.1078g洋桔梗，加入提取液進行冰浴勻漿，按照測定步驟操作，用1mL石英比色皿測得計算A測定=A1測定-A2測定=1.07-1.038=0.032，A空白=A1空白-A2空白=0.823-0.807=0.016，?A =A測定-A空白=0.016。帶入公式計算：
UFGT活力(U/g 質量)= 4019.29×ΔA÷W=596.56 U/g 質量
2、 稱取0.1133g洋蔥，加入提取液進行冰浴勻漿，按照測定步驟操作，用1mL石英比色皿測得計算A測定=A1測定-A2測定=0.838-0.809=0.029，A空白=A1空白-A2空白=0.823-0.807=0.016，?A =A測定-A空白=0.013。帶入公式計算：
UFGT活力(U/g 質量)= 4019.29×ΔA÷W=461.17 U/g 質量
[1] Parvaneh, TaherehAbedi, BahramDavarynejad, Gholam HosseinMoghadam, Ebrahim Ganji. Enzyme activity, phenolic and flavonoid compounds in leaves of Iranian red flesh apple culti vars grown on different rootstocks[J]. Scientia horticulturae, 2019, 246.
[2] Mori K, Sugaya S, Gemma H. Decreased anthocyanin biosynthesis in grape berries grown under elevated night temperature condition[J]. Hort, 2005, 105(3):319-330.
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