北京索萊寶科技有限公司
專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC5550-50T/24S
更新時間：2024-04-22
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：962
010-50973130
產品分類
可見分光光度法
貨號：BC5550
規格：50T/24S
產品內容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液一 | 液體30 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液二 | 液體0.3 mL×1支 | -20℃保存 |
試劑一 | 粉劑×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 液體10mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 液體25mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑四 | 液體36mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑五 | 液體15mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
標準品 | 液體1mL×1支 | 2-8℃保存 |
2. 提取液的配制：按提取液一︰提取液二=990µL：10µL（1T）的比例配制，根據樣本量現配現用，禁止將提取液二一次性全部加入提取液一中。
3. 試劑一：臨用前加入9.6mL試劑二，充分溶解，請勿放置于-20℃保存。2-8℃可保存4周。
4. 標準品：1mol/L（即1000μmol/mL）尿素標準液。
產品說明：
精*酸酶（Arginase）又稱L-精*酸尿素水解酶或L-精*酸脒基水解酶，是一種錳金屬酶。*酸酶存在于細菌、酵母、植物、無脊椎動物和脊椎動物中，并被認為最早出現在細菌中。微生物體內的精*酸酶其主要功能可能是參與維持L-*的動態平衡，并參與調控多種重要代謝過程。
精*酸酶將L-*酸（L-arginine）分解為L-鳥*酸（L-ornithine）和尿素（urea），尿素與α-異亞硝基苯*酮反應生成560nm處存在吸收峰的衍生物，通過測定尿素的生成量，可計算得到精*酸活性大小。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、分析天平、可調式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、蒸餾水和冰。
操作步驟：
一、 樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1、 組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），
進行冰浴勻漿。12000g 4℃離心20min，取上清，置冰上待測。
2、 細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；12000g 4℃離心20min，取上清，置冰上待測。
二、測定步驟
1、 可見分光光度計預熱30min以上，調節波長至560nm，用蒸餾水調零。
2、 標準溶液的制備：將標準品用蒸餾水分別稀釋為50、25、12.5、6.25、3.125 μmol/mL的標準溶液。
3、 標準品稀釋表
序號 | 稀釋前濃度（μmol/mL） | 標準液體積（µL） | 蒸餾水體積（µL） | 稀釋后濃度（μmol/mL） |
1 | 1000 | 100 | 1900 | 50 |
2 | 50 | 500 | 500 | 25 |
3 | 25 | 500 | 500 | 12.5 |
4 | 12.5 | 500 | 500 | 6.25 |
5 | 6.25 | 500 | 500 | 3.125 |
實驗中每個標準管需240µL標準溶液。
4、在1.5mLEP管中按下表步驟加樣：
試劑名稱（μL） | 測定管 | 對照管 | 標準管 | 標準空白管 |
樣本 | 240 | 240 | - | - |
標準品 | - | - | 240 | - |
蒸餾水 | - | - | - | 240 |
試劑一 | 120 | 120 | 120 | 120 |
試劑三 | 360 | 360 | 360 | 360 |
試劑四 | - | 480 | 480 | 480 |
37℃避光反應30min | ||||
試劑四 | 480 | - | - | - |
8000g 常溫離心5min，另取一支1.5mLEP，吸取1000μL上清液于EP管中 | ||||
上清液 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |
試劑五 | 200 | 200 | 200 | 200 |
沸水浴避光反應40min，冰水冷卻，8000g 常溫離心5min，吸取上清于比色皿中，測定在560nm處的吸光度，記作A測定，A對照，A標準，A標準空白。?A測定=A測定-A對照，?A標準=A標準-A標準空白。（標準管和標準空白管只需做1-2次，每個測定管需設置一個對照管。） | ||||
根據標準管的濃度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA標準（y，ΔA標準），建立標準曲線。根據標準曲線，將ΔA測定代入方程得到x（μmol/mL）。
2. 精氨*酶活計算
(1) 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：37℃每mg組織蛋白每分鐘催化產生1μmol 尿素定義為一個酶活力單位。
精*酶活性（U/mg prot）=x×V樣÷（Cpr×V樣）÷T×F= x÷30÷Cpr×F
(2) 按樣本質量計算
單位的定義：37℃每g組織每分鐘催化產生1μmol尿素定義為一個酶活力單位。
精*酸酶活性（U/g 質量）= x×V樣÷（W÷V樣總×V樣）÷T×F= x÷30÷W×F
(3) 按細菌或細胞數目計算
單位的定義：37℃每106個細菌或細胞每分鐘催化產生1μmol尿素定義為一個酶活力單位。
精*酸酶活性（U/106 cell）= x×V樣÷（N÷V樣總×V樣）÷T×F= x÷30÷N×F
V樣：反應體系中加入的樣本體積，0.24mL；V樣總：加入的提取液體積，1mL；T：反應時間，30min；Cpr：蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；N：細胞或細菌數目，以106計；F：樣本稀釋倍數。
注意事項：
1、 如果測定吸光值大于1.5或?測定大于1，可以對樣本進行稀釋或者縮短第一步37℃反應時間；測定吸光值或?測定過小，可以加大樣本量或者延長第一步37℃反應時間。最終計算時同步修改計算公式。
實驗實例：
1、 稱取0.1198g小鼠腎臟組織，加入提取液進行冰浴勻漿，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算?A測定=A測定-A對照=0.740-0.033=0.707，帶入標準曲線y=0.0225x-0.0295（R2=0.9966），x=32.733μmol/mL，帶入公式計算：
精*酸酶活性（U/g 質量）= x÷30÷W×F =9.108U/g 質量
2、 稱取0.0989g胡蘿卜，加入提取液進行冰浴勻漿，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算?A測定=A測定-A對照=0.109-0.013=0.096，帶入標準曲線y=0.0225x-0.0295（R2=0.9966），x=5.578μmol/mL，帶入公式計算：
精*酸酶活性（U/g 質量）= x÷30÷W×F =1.880 U/g 質量
[1] Chen H, Mccaig B C, Melotto M, et al. Regulation of Plant Arginase by Wounding, Jasmonate, and the Phytotoxin Coronatine[J]. Journal of Biological Chemistry, 2004, 279(44):45998-46007.
[2] Ishii N, Ikenaga H, Carmines P K, et al. High glucose augments arginase activity and nitric oxide production in the renal cortex[J]. Metabolism, 2004, 53(7):868-874.
[3] Zharikov S, Krotova K, Hu H, et al. Uric acid decreases NO production and increases arginase activity in cultured pulmonary artery endothelial cells[J]. American Physiological Society, 2008(5).
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