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專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC5530-50T/24S
更新時間：2024-04-19
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：1017
010-50973130
產品分類
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土壤丙酮酸（S-PA）含量檢測試劑盒（酶法）說明書
可見分光光度法
貨號：BC5530
規格：50T/24S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
溶液的配制：
1、 試劑二：臨用前加入3.6mL蒸餾水充分溶解，分裝保存，-20℃可以保存4周，避免反復凍融。
2、 試劑三：臨用前按試劑三：蒸餾水=10μL：1mL（共1.01mL，約13T）的比例進行稀釋，現用現配。
3、 標準品：20μmol/mL丙酮酸鈉標準液。
產品說明：
丙酮酸通過乙酰CoA連接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代謝，起著重要的樞紐作用。
在pH=7.5時，丙酮酸在LDH的催化作用下與NADH反應，生成NAD +和乳酸。在1-mPMS作用下，WST-1可與NADH反應，產生水溶性Formazan。通過檢測450nm條件下吸光值，可以計算出丙酮酸含量。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、可調式移液槍、1mL玻璃比色皿、研缽、超聲清洗儀、30-50目篩和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
新鮮土樣自然風干或37℃烘箱風干，過30~50目篩。
稱取風干混勻土樣約0.1g，加入1mL蒸餾水混勻；然后置于超聲清洗儀常溫超聲30min。然后12000g，常溫離心10min，取上清液待測。
二、測定步驟
1、 分光光度計預熱30min以上，調節波長到450nm，蒸餾水調零。
2、 試劑一37℃預熱20min以上。
3、 標準品的制備：將20μmol/mL丙酮酸鈉標準液用蒸餾水稀釋得到0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125μmol/mL標準溶液備用。
4、 標準品稀釋表：
序號 | 稀釋前濃度（μmol/mL） | 標準液體積（µL） | 蒸餾水體積（µL） | 稀釋后濃度（μmol/mL） |
1 | 20 | 50 | 950 | 1 |
2 | 1 | 500 | 500 | 0.5 |
3 | 0.5 | 500 | 500 | 0.25 |
4 | 0.25 | 500 | 500 | 0.125 |
5 | 0.125 | 500 | 500 | 0.0625 |
6 | 0.0625 | 500 | 500 | 0.03125 |
實驗中每個標準管需100µL標準溶液。
5、 操作表：(在1.5mLEP管中加入下列試劑)
測定管 | 對照管 | 標準管 | 空白管 | |
上清液 | 100 | 100 | - | - |
標準品 | - | - | 100 | - |
蒸餾水 | - | - | - | 100 |
試劑一 | 775 | 900 | 775 | 775 |
試劑二 | 50 | - | 50 | 50 |
試劑三 | 75 | - | 75 | 75 |
混勻后37℃反應30min | ||||
試劑四 | 100 | 100 | 100 | 100 |
混勻后37℃避光反應30min。于1mL玻璃比色皿，測定450nm下的吸光度，計算ΔA測定= A空白-(A測定-A對照)， ΔA標準=A空白-A標準。（標準曲線和空白管只需測1-2次即可） | ||||
三、土壤丙酮酸含量計算
1、標準曲線繪制：
根據標準管的濃度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA標準（y，ΔA標準），建立標準曲線。根據標準曲線，將ΔA測定代入方程得到x（μmol/mL）。
2、土壤丙酮酸含量計算：
土壤丙酮酸含量（μmol/g 質量）= x×V樣÷(V樣÷V提×W) = x÷W
V樣：加入的樣本體積，0.1mL；V提：前處理中加入蒸餾水的體積，1mL；W：樣本質量，g。
注意事項：
1. 如果測定吸光值超過線性范圍吸光值，可以增加樣本量或者用蒸餾水稀釋樣本后再進行測定。
實驗實例：
1、 稱取約0.103g花盆土，加入1mL蒸餾水，超聲破碎30min，10000g，常溫離心10min，取上清待測。之后按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算ΔA測定= A空白-（A測定-A對照）=0.843-（0.493-0.028）=0.378，標曲y=1.4576x-0.0002，R2=0.9924，x=0.2595µmol/mL, 計算丙酮酸含量得：
丙酮酸含量（µmol/g 質量）= x×V樣 ÷(V樣÷V提×W) = x÷W =2.5191µmol/g 質量。
2、 稱取約0.101g污泥，加入1mL蒸餾水，超聲破碎30min，10000g，常溫離心10min，取上清待測。之后按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算ΔA測定= A空白-（A測定-A對照）=0.843-（0.528-0.135）=0.450，標曲y=1.4576x-0.0002，R2=0.9924，x=0.3089µmol/mL, 計算丙酮酸含量得：
丙酮酸含量（µmol/g 質量）= x×V樣 ÷(V樣÷V提×W) = x÷W =3.0581µmol/g 質量。
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