ATP含量檢測試劑盒（WST顯色法）說明書

微量法

貨號：BC5475

規格：100T/96S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 提取液：低溫條件下，可能有結晶析出，放于60℃水浴加熱溶解即可，不影響使用；

2、 試劑二：臨用前加入3.5 mL蒸餾水充分溶解，可加熱促進溶解，用不完的試劑2-8℃保存4周；

3、 試劑四：臨用前取1支加入0.2 mL蒸餾水溶解，用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復凍融；為延長試劑盒使用時間故多提供一支；

4、 試劑五：臨用前加入1 mL蒸餾水充分溶解，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融；

5、 試劑六：臨用前取1支加入0.25 mL蒸餾水備用，用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復凍融；為延長試劑盒使用時間故多提供一支；

6、 標準品：5 mg ATP。臨用前加入0.826 mL蒸餾水配成10 μmol/mL的ATP標準溶液，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融；

7、 0.4μmol/mL 標準溶液的配制：臨用前吸取20μL 10 μmol/mL的ATP標準溶液和480μL蒸餾水混合配制成0.4μmol/mL 標準溶液，用于標準管的測定；

8、 工作液的配制：臨用前按試劑二(mL)：試劑三(mL)：試劑四(mL)：試劑五(mL)：試劑六(mL)=0.2mL：0.2mL：0.02mL：0.08mL：0.02mL的比例配制（0.52mL，約10T的量），現配現用。

產品說明：

ATP廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，是生物能量通貨，能荷是描述細胞能量代謝狀態的主要參數。測定ATP 含量并且計算能荷，能夠反映能量代謝狀態。

HK催化葡萄糖和ATP合成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脫氫酶進一步催化6-磷酸葡萄糖脫氫生成NADPH，WST-1 可與 NADPH 反應，產生水溶性 formazan，在 450nm 下有特征吸收峰。

技術指標：

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋/恒溫培養箱、低溫離心機、可調式移液槍、微量玻璃比色皿/ 96孔板、研缽/勻漿器/超聲波細胞破碎儀、蒸餾水、冰和氯仿。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1、 血清（漿）中ATP 的提取：按照血清（漿）體積（mL）：提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1mL血清（漿），加入1mL 提取液）混合，充分震蕩，10000g，4℃離心10min；取上清液至另一EP 管中，加入500μL的氯仿充分震蕩混勻，10000g 4℃離心3min，取上清，置冰上待測（不可用于蛋白質含量測定）。

2、 組織中ATP 的提取：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g 組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿，10000g 4℃離心10min，取上清至另一EP 管中，加入500μL的氯仿充分震蕩混勻，10000g 4℃離心3min，取上清，置冰上待測（不可用于蛋白質含量測定）。

3、 細胞或細菌中ATP 的提取：先收集細胞或細菌到離心管內，棄上清，按照細菌或細胞數量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎（冰浴，功率200W，超聲2s，停1s，總時間1min），10000g 4℃離心10min；取上清液至另一EP管中，加入500μL的氯仿充分震蕩混勻，10000g 4℃離心3min，取上清，置冰上待測（不可用于蛋白質含量測定）。

注：以上提取過程嚴格控制在冰浴條件下進行。

二、測定步驟

1、 可見分光光度計/酶標儀預熱30 min 以上，調節波長到450nm，分光光度計用蒸餾水調零。

2、 試劑一置于37℃水浴鍋/恒溫培養箱中預熱15min以上。

3、 （按下表在1.5mLEP管或96孔板中加入相應試劑）

充分混勻，吸取200μL反應液于微量玻璃比色皿或者96孔板中測定450nm處的吸光值，記為A測定、A標準、A空白，計算ΔA測定=A測定-A空白，ΔA標準=A標準-A空白（空白管和標準管只需做1-2次）。

三、ATP 含量計算

1、 血清（漿）中ATP 含量計算

ATP含量(μmol/mL) = C標準×ΔA測定÷ΔA標準×（V提取+V血清（漿））÷V血清（漿）

=4.4×ΔA測定÷ΔA標準

2. 按樣本質量計算

ATP含量（μmol/g 質量）= C標準×ΔA測定÷ΔA標準×V提取÷W =0.4×ΔA測定÷ΔA標準÷W

3. 按蛋白濃度計算：

ATP含量（μmol/mg prot）= C標準×ΔA測定÷ΔA標準×V樣本÷（V樣本×Cpr）=0.4×ΔA測定÷ΔA標準÷Cpr

4. 按細菌或細胞數量計算

ATP含量(μmol/10⁴ cell）= C標準×ΔA測定÷ΔA標準×V提取÷N = 0.4×ΔA測定÷ΔA標準÷N

C標準：標準溶液濃度，0.4μmol/mL；V提取：加入的提取液體積，1mL；V血清（漿）：血清（漿）體積，0.1mL；V樣本：反應體系中加入的樣本體積：0.02mL；W：樣本質量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；N：細胞或細菌總數，以10⁴個。

注意事項：

1、 加入提取液離心后的上清若為渾濁為正常現象。

2、 如果ΔA測定>1.5，建議將樣本用蒸餾水稀釋后進行測定。注意計算公式中乘以稀釋倍數；如果吸光值過低或接近空白，建議統一放置于37℃水浴鍋/恒溫培養箱中培養2h或更長時間后再次測定，也可以加大樣本量后進行測定，注意同步修改計算公式。

3、 提取液中含蛋白變性成分，若按蛋白濃度計算需要另取樣本重新計算。

實驗實例：

1、 取0.108g兔肌肉組織加入1mL提取液進行冰浴勻漿，10000g 4℃離心10min，取上清至另一EP管中，加入500μL的氯仿充分震蕩混勻，10000g 4℃離心3min，取上清，置冰上按照測定步驟操作，使用96孔板測得計算ΔA測定=0.222-0.118=0.104，ΔA標準=A標準-A空白=0.466-0.118=0.348，按樣本質量計算含量得：

ATP含量（μmol/g 質量）=0.4×ΔA測定÷ΔA標準÷W=1.107μmol/g 質量。

2、 取0.1g 蒜苗加入1mL提取液進行冰浴勻漿，10000g 4℃離心10min，取上清至另一EP管中，加入500μL的氯仿充分震蕩混勻，10000g 4℃離心3min，取上清，置冰上按照測定步驟操作，使用96孔板測得計算ΔA測定=0.284-0.118=0.166，ΔA標準=A標準-A空白=0.466-0.118=0.348，按樣本質量計算含量得：

ATP含量（μmol/g 質量）=0.4×ΔA測定÷ΔA標準÷W=1.908μmol/g 質量。

參考文獻

[1] Lin X, Wu Y, Chen X, et al. Determination of adenosine phosphate in tobacco leaf by UPLC with phenol-TEA pretreatment [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2014, 20(1): 26-31.

[2] Beutler E, Mathai C K. A comparison of normal red cell ATP levels as measured by the firefly system and the hexokinase system[J]. Blood, 1967, 30(3): 311-320.

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