北京索萊寶科技有限公司
專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC5430-50T/48S
更新時間：2024-04-19
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：1136
010-50973130
產品分類
羥甲基戊二酰輔*A合成酶（HMGCS）活性檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
貨號：BC5430
規格：50T/48S
產品內容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液 | 液體60mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 粉劑×1支 | -20℃保存 |
試劑二 | 粉劑×1支 | -20℃保存 |
試劑三 | 液體15mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 試劑一：臨用前加入1mL蒸餾水充分溶解。-20℃分裝以保存4周，避免反復凍融。
2、 試劑一工作液的配制：按照試劑一：蒸餾水=50μL：1150μL（1.2mL，約9T）的比例配制，根據樣本量現配現用，當天用完。
3、 試劑二：臨用前加入1mL蒸餾水充分溶解。-20℃分裝以保存4周，避免反復凍融。
4、 試劑二工作液的配制：按照試劑二：蒸餾水=100μL：1100μL（1.2mL，約9T）的比例配制，根據樣本量現配現用，當天用完。
產品說明：
甲羥戊酸途徑 是一個非常重要的代謝途徑，參與許多重要萜類的前體物的合成，是萜類生物合成的重要途徑。羥甲基戊二酰輔*A合成酶催化乙酰CoA和乙酰乙酰CoA，生成羥甲基戊二酰輔*A，是膽*醇和類異 戊二烯生物合成中的關鍵步驟。
HMGCS催化乙酰CoA與乙酰乙酰CoA生成羥甲基戊二酰CoA，同時產生CoASH，使DTNB轉化為黃色的TNB，在412nm下有特征吸光值。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、分析天平、水浴鍋/恒溫培養箱、臺式離心機、可調式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、蒸餾水和冰。
操作步驟：
一、 樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1. 組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），
進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2. 細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（106個）：提取液體積（mL）為5~10：1的比例（建議5百萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
二、 測定步驟
1. 可見分光光度計預熱30min以上，調節波長至412nm，蒸餾水調零。
2. 根據樣本量取部分試劑一工作液、試劑二工作液、試劑三于37℃預熱10min。
3. 操作表：（在微量玻璃比色皿中加入下列試劑）
試劑名稱（μL） | 測定管 | 空白管 |
試劑一工作液 | 125 | 125 |
試劑二工作液 | 125 | 125 |
試劑三 | 250 | 250 |
樣本 | 500 | - |
提取液 | - | 500 |
將上述試劑加入微量玻璃比色皿中充分混勻，于412nm處測定10s時的吸光值A1，迅速置于37℃水浴鍋或者恒溫培養箱中反應20min，拿出迅速擦干測定20min10s時的吸光值A2，記錄412nm下10s時吸光值A1和20min后的吸光值A2。計算ΔA測定=A2測定-A1測定，ΔA空白=A2空白-A1空白，ΔA=ΔA測定-ΔA空白。空白管只需做1-2次。
三、HMGCS活性計算
1. 按蛋白濃度計算
酶活定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產生1nmol TNB為一個酶活力單位。
HMGCS活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×109×V反總÷（V樣×Cpr）÷T=7.353×ΔA÷Cpr
2. 按樣本質量計算
酶活定義：每g組織每分鐘催化產生1nmol TNB為一個酶活力單位。
HMGCS活性（U/g 質量）＝ΔA×V反總÷（ε×d）×109÷（W ×V 樣÷V 樣總）÷T=7.353×ΔA÷W
3. 按細胞/細菌數量計算
酶活定義：每106個細菌或細胞每分鐘催化產生1nmol TNB為一個酶活力單位。
HMGCS活性（U/106 cell）＝ΔA×V反總÷（ε×d）×109÷（N×V樣÷V樣總）÷T=7.353×ΔA÷N
V反總：反應體系總體積，1×10-3L；ε：TNB摩爾消光系數，1.36×104L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.5mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，20min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；N：細胞或細菌總數，以106計。
注意事項：
1. 如果ΔA吸光值過低或接近空白，適當延長反應時間或加大樣本量后，重新測定。注意同步修改計算公式。
2. 如果A2＞1或者ΔA＞0.8，建議將樣本適當稀釋后或者縮短反應時間進行測定。注意同步修改計算公式。
實驗實例：
1、 稱取0.1046g平菇，加入提取液進行冰浴勻漿，提取液將上清稀釋2倍，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算?A測定=A2測定-A1測定=0.901-0.565=0.336，?A空白=A2空白-A1空白=0.150-0.103=0.047，?A=?A測定-?A空白=0.289，按樣本質量計算酶活得：
HMGCS活性（U/g 質量）＝7.353×ΔA÷W×2=40.63 U/g 質量
2、 稱取0.1070g青椒，加入提取液進行冰浴勻漿，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算?A測定=A2測定-A1測定=0.476-0.340=0.136，?A空白=A2空白-A1空白=0.150-0.103=0.047，?A=?A測定-?A空白=0.089，按樣本質量計算酶活得：
HMGCS活性（U/g 質量）＝7.353×ΔA÷W=6.12 U/g 質量
參考文獻：
[1] Skaff D A, Miziorko H M. A visible wavelength spectrophotometric assay suitable for high-throughput screening of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase[J]. Analytical Biochemistry, 2010, 396(1):96-102
[2] Scharnagl H, W M?rz, Schliack M, et al. A novel assay for cytosolic 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A synthase activity using reversed-phase ion-pair chromatography: demonstration that Lifibrol (K12.148) modulates the enzyme activity[J]. Journal of Lipid Research, 1995, 36(3):622-627.
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