高密度脂蛋白膽*醇（HDL-C）含量檢測試劑盒說明書

微量法

注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作

貨號：BC5325

規格：100T/96S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 提取液一：自備異丙醇，大約需要110mL，常溫保存；試劑盒內提供一個30mL棕色空瓶，僅做分裝使用，請自行標注試劑名稱。

2. 提取液二：臨用前根據樣本量按提取液二A：提取液二B=50μL：50μL（約1T）的比例配制成提取液二，當天用完。

3. 試劑四：液體置于試劑瓶內EP管中。

4. 標準品：10 mg膽*醇，臨用前加入517 μL提取液一，振蕩溶解，即為50 μmol/mL的膽*醇標準溶液。

5. 工作液的配制：根據樣本量按試劑一：試劑二：試劑三：試劑四=0.21mL：2.79mL：20 μL：3 μL（共3.023mL，約16T）的比例配制工作液，現用現配。

產品說明：

高密度脂蛋白（High-Density Lipoprotein Cholesterol，HDL-C）是血清脂蛋白中密度最大、顆粒最小的脂蛋白，主要作用為將周圍組織的膽*醇運送到肝臟進行降解。眾多流行病學研究表明，HDL-C水平與動脈粥樣硬化（AS）、冠心病（GHD）呈負相關，對于臨床診斷動脈粥硬化、冠心病、高血壓等疾病有重要參考價值。

使用選擇性沉淀劑將HDL-C特異性分離出來，利用酯酶催化膽*醇酯水解生成游離膽*醇（FC）和游離脂肪酸（FFA），從而把膽*醇酯轉化為FC；進一步利用膽*醇氧化酶催化FC氧化，生成4-膽甾烯酮和H₂O₂；最后利用過氧化物酶催化H₂O₂氧化4-氨基安*比林和苯胺類似物，生成紫色化合物，其在546nm有特征吸收峰，其顏色深淺與HDL-C含量成正比。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、天平、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、可調式移液槍、冰、蒸餾水、異丙醇。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 組織：按照組織質量（g）：提取液一體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液一）進行冰浴勻漿。10000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。

2. 細菌/細胞：按照細胞數量（10⁴個）：提取液一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300W，超聲2秒，間隔3秒，總時間3min）；然后10000g，4℃離心10min，取上清置于冰上待測。

3. 血清（漿）等液體樣本：直接測定。若有沉淀請離心后取上清待測。

二、測定步驟

1. 可見分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節波長至546nm，分光光度計蒸餾水調零。

2. 標準溶液的稀釋：將50μmol/mL膽*醇標準溶液用提取液一進行稀釋得到2.5、2、1.25、0.625、0.3125、0.15625μmol/mL的標準溶液備用。

3. 標準溶液稀釋可參考下表：

備注：實驗中每個標準管需100µL標準溶液。

4. 在1.5mLEP管按下表步驟加樣：

充分混勻，37℃靜置1h，反應完成后測定546nm處吸光值A，分別記為A測定、A標準和A空白，ΔA測定=A測定-A空白，ΔA標準=A標準-A空白。空白管和標準曲線只需測1-2次。

注：若樣本為血清（漿）等液體樣本，則需要增加‘血清（漿）空白管’-即將空白管中的提取液一（異丙醇）更換為蒸餾水進行實驗，計算ΔA測定=A測定-A血清（漿）空白，標準管測定及ΔA標準計算不變。

三、高密度脂蛋白膽*醇含量計算

1. 標準曲線的繪制：

根據標準管的濃度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA標準（y，ΔA標準），建立標準曲線。根據標準曲線，將ΔA測定（y，ΔA測定）帶入公式計算樣本濃度（x，μmol/mL）。

2. HDL-C含量的計算：

（1）按血清（漿）等液體體積計算：

HDL-C含量（μmol/dL）=x×100

（2）按樣本蛋白濃度計算：

HDL-C含量（μmol/mg prot）=x×V提取÷（Cpr×V提取）=x÷Cpr

（3）按樣本質量計算：

HDL-C含量（μmol/g 質量）=x×V提取÷W=x÷W

（4）按細胞/細菌數量計算：

HDL-C含量(μmol/10⁴ cell)=x×V提取÷N=x÷N

100：單位換算系數，1dL=100mL；V提取：加入提取液一的體積，1mL；W：樣本質量，g；N：細菌或細胞總數，以萬計。

注意事項：

1. 如果測定吸光值超過線性范圍吸光值，可以增加樣本量或者用提取液一稀釋樣本后再進行測定。注意同步修改計算公式。

2. 提取液一中含有使蛋白變形的成分，故按蛋白濃度計算時需要重新提取蛋白進行測定。

實驗實例：

1、 取0.1mL人血清樣本，按照測定步驟操作，使用96孔板測得計算ΔA測定=A測定-A空白=0.142-0.060=0.082，根據標準曲線y=0.3888x-0.0502，計算x=0.340，按血清（漿）等液體體積計算：

HDL-L含量（μmol/dL）=x×100=0.340×100=34.002 μmol/dL。

2、 取0.1g魚肝樣本，加入1mL提取液一，冰浴勻漿，離心后取上清按照測定步驟操作，使用96孔板測得計算ΔA測定=A測定-A空白=0.089-0.060=0.029，根據標準曲線y=0.3888x-0.0502，計算x=0.204，按樣本質量計算：

HDL-L含量（μmol/g 質量）=x÷W=0.204÷0.1=2.037 μmol/g 質量。

參考文獻：

[1] Warnick G R, Nauck M, Rifai N I. Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays[J]. Clinical Chemistry, 2001, 47(9):1579-1596.

[2] Yan S, Lin Q. Methods for Detection of High-Density Lipoprotein Cholesterol and its Standardization[J]. Chinese Journal of Laboratory Medicine, 1998, 21(1): 19-22.

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