糖化血清蛋白（GSP）含量檢測試劑盒（NBT法）說明書

微量法

貨號：BC494

規格：100T/96S

產品內容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

標準品：臨用前加入0.8 mL試劑二，充分溶解，配制成10 mmol/L DMF標準液，2-8℃保存4周；取20µL 10 mmol/L DMF標準液和30µL試劑二混合配制成4 mmol/L標準溶液待測。

產品說明：

血清葡萄糖與白蛋白及其它血清蛋白分子N末端的氨基發生非酶促糖化反應，形成高分子酮胺結構，在堿性條件下與硝基四氯唑藍反應，生成紫紅色化合物甲臜。在530nm波長處比色，測定其OD值，與DMF標準比較，即可求得其含量。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、低溫離心機、恒溫培養箱、可調式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

血清（漿）：收集血清（漿）到離心管內，按照血清（漿）體積（mL）∶試劑一體積（mL）= 10∶1的比例（建議吸取0.2 mL血清（漿）于EP管中，加入0.02 mL試劑一），充分混勻，于37℃保溫30 min。

二、測定步驟

1、 可見分光光度計/酶標儀預熱30 min以上，調節波長至530 nm，蒸餾水調零。

2、 標準溶液：按照標準溶液體積（mL）∶試劑一體積（mL）= 10∶1的比例（建議吸取0.2 mL 4 mmol/L標準溶液于EP管中，加入0.02 mL試劑一），充分混勻，于37℃保溫30 min。

3、 按下表步驟加樣：

注：空白管和標準空白管均只需做1-2次。

三、糖化血清蛋白含量計算

糖化血清蛋白含量（mmol/L）=C×ΔA測定÷ΔA標準×F=4×ΔA測定÷ΔA標準×F

C：標準溶液濃度，4 mmol/L；F：稀釋倍數。

注意事項：

1、顯色完成后，應立即加入試劑四；建議一次性不要做太多樣本，防止試劑四加入不及時導致測定結果受到影響。

2、如果測定吸光值A＞1.5或ΔA＞1，建議稀釋樣本后再測定，計算公式中乘以稀釋倍數；如果測定吸光值較低或接近空白OD值，建議增加操作表中的樣本量后再進行測定（空白管、標準管、標準空白管需要增加至相同體積量）。

實驗實例：

1、 取0.2 mL小鼠血清加入0.02 mL試劑一，充分混勻，于37℃保溫30 min。標準溶液處理同上。按照測定步驟操作，用96孔板測定計算ΔA測定=A測定-A空白=0.252-0.044=0.208，ΔA標準=A標準-A標準空白=0.227-0.101=0.126，按公式計算小鼠血清中糖化血清蛋白含量：
糖化血清蛋白含量（mmol/L）= C×ΔA測定÷ΔA標準=4×0.208÷0.126=6.603 mmol/L。

2、 取0.2 mL馬血清加入0.02 mL試劑一，充分混勻，于37℃保溫30 min。標準溶液處理同上。按照測定步驟操作，用96孔板測定計算ΔA測定=A測定-A空白=0.1-0.044=0.056，測定ΔA標準=A標準-A標準空白=0.227-0.101=0.126，按公式計算血清中糖化血清蛋白含量：
糖化血清蛋白含量（mmol/L）= C×ΔA測定÷ΔA標準=4×0.056÷0.126=1.778 mmol/L。

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