輔酶Ⅰ NAD(H)含量檢測(cè)試劑盒說明書
微量法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。
貨號(hào)：BC0315
規(guī)格：100T/48S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：
1、試劑三：需要嚴(yán)格避光；
2、試劑六：19.2 mL乙醇和0.8 mL蒸餾水混合，備用；
3、NAD標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入1.5 mL蒸餾水，即2 µmol/mL，將其稀釋為1.25 nmol/mL的NAD標(biāo)準(zhǔn)溶液備
用；
4、NADH標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入1.4 mL蒸餾水，即2 µmol/mL，將其稀釋為1.25 nmol/mL的NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。
產(chǎn)品說明：
輔酶I包括還原型和氧化型兩種形式，在生物氧化中起傳遞氫的作用。氧化型輔酶I又稱煙*胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）是脫氫酶的輔酶，它在糖酵解、糖異生、三羧酸循環(huán)和呼吸鏈中發(fā)揮著不可替代的作用。中間產(chǎn)物會(huì)將脫下的氫遞給NAD，使之成為NADH（還原型輔酶I）。而NADH則會(huì)作為氫的載體，在呼吸鏈中通過化學(xué)滲透偶聯(lián)的方式，合成ATP。NAD(H)在機(jī)體內(nèi)有重要的生理意義，與物質(zhì)代謝、能量代謝、抗細(xì)胞衰老、抗氧化以及一些疾病的發(fā)生密切相關(guān)。體內(nèi)輔酶I含量降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷或衰亡。
分別用酸性和堿性提取液提取樣本中NAD⁺和NADH，NADH通過PMS的遞氫作用，還原氧化型噻唑藍(lán)（MTT）為甲瓚，在570nm下檢測(cè)吸光值，而NAD⁺可被乙醇脫氫酶還原為NADH，進(jìn)一步采用MTT還原法檢測(cè)。
注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟： 具體操作步驟詳見“產(chǎn)品資料"附件
注意事項(xiàng)：
1、操作過程應(yīng)避光。不可將試劑一、二、三混合后再加，必須分開加。
2、反應(yīng)過程要注意避光。
3、當(dāng)吸光值大于1時(shí)，建議稀釋后測(cè)量。
實(shí)驗(yàn)實(shí)例：
 

1. NAD⁺的提取：稱取約0.1g肌肉按照提取和測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定= A測(cè)定-A對(duì)照=0.507-0.2=0.307，ΔA標(biāo)準(zhǔn)1=A標(biāo)準(zhǔn)1-A空白=0.612-0.144=0.468，按樣本質(zhì)量計(jì)算NAD⁺ 含量得：NAD⁺ (nmol/g 質(zhì)量）=1.25×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)1÷W=1.25×0.307÷0.468÷0.1=8.1998 nmol/g 質(zhì)量。

NADH的提取：稱取約0.1g肌肉按照提取和測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定= A測(cè)定-A對(duì)照=0.183-0.077=0.106，ΔA標(biāo)準(zhǔn)2=A標(biāo)準(zhǔn)2-A空白=0.399-0.143=0.256，按樣本質(zhì)量計(jì)算NADH 含量得：NADH  (nmol/g 質(zhì)量）=1.25×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)2÷W=1.25×0.106÷0.256÷0.1=5.1758 nmol/g 質(zhì)量。

1. NAD⁺的提取：稱取約0.1g柳樹葉，按照提取和測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定= A測(cè)定-A對(duì)照=0.171-0.101=0.07，ΔA標(biāo)準(zhǔn)1=A標(biāo)準(zhǔn)1-A空白=0.612-0.144=0.468，按樣本質(zhì)量計(jì)算NAD⁺ 含量得：NAD⁺ (nmol/g 質(zhì)量）=1.25×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)1÷W=1.25×0.07÷0.468÷0.1=1.8697 nmol/g 質(zhì)量。

NADH的提取：稱取約0.1g柳樹葉，按照提取和測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定= A測(cè)定-A對(duì)照=0.152-0.099=0.053，ΔA標(biāo)準(zhǔn)2=A標(biāo)準(zhǔn)2-A空白=0.399-0.143=0.256，按樣本質(zhì)量計(jì)算NADH 含量得：NADH  (nmol/g 質(zhì)量）=1.25×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)2÷W=1.25×0.053÷0.256÷0.1=2.5879 nmol/g 質(zhì)量。

1. NAD⁺的提取：取0.1mL火雞血清，按照提取和測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定= A測(cè)定-A對(duì)照=0.120-0.071=0.049，ΔA標(biāo)準(zhǔn)1=A標(biāo)準(zhǔn)1-A空白=0.612-0.144=0.468，按液體體積計(jì)算NAD⁺ 含量得：NAD⁺含量(nmol/mL）=12.5×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)1=12.5×0.049÷0.468=1.3088 nmol/mL。

NADH的提取：取0.1mL馬火雞血清，按照提取和測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定管= A測(cè)定-A對(duì)照=0.089-0.065=0.024，ΔA標(biāo)準(zhǔn)2=A標(biāo)準(zhǔn)2-A空白=0.399-0.143=0.256，按液體體積計(jì)算NADH 含量得：NADH含量(nmol/mL）=12.5×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)2=12.5×0.024÷0.256=1.1719 nmol/mL。
相關(guān)發(fā)表文獻(xiàn)：

1. Xiaofen Fu,Pengsong Li,Lei Zhang,et al. Understanding the stress responses of Kluyveromyces marxianus after an arrest during high-temperature ethanol fermentation based on integration of RNA-Seq and metabolite data. Applied Microbiology and Biotechnology. March 2019;103(6) :2715–2729.(IF3.67)

2. Mengqing Tao,Jia Jiang,Lin Wang,et al. α-Mangostin Alleviated Lipopolysaccharide Induced Acute Lung Injury in Rats by Suppressing NAMPT/NAD Controlled Inflammatory Reactions. Evidence-Based Complementary and

Alternative Medicine. 2018;(IF1.984)

1. Bin Zhang,Dongmei Shi, Xiangyu Zhang,et al. FK866 inhibits the epithelial-mesenchymal transition of hepatocarcinoma MHCC97-H cells. Oncology Letters. October 2018;(IF1.871)

2. Yang K, Yin Q, Mao Q, et l. Metabolomics analysis reveals therapeutic effects of α-mangostin on collagen-induced arthritis in rats by down-regulating nicotinamide phosphoribosyltransferase[J]. Inflammation, 2019, 42(2): 741-753.

參考文獻(xiàn)：

1. Ying W. NAD⁺/NADH and NADP⁺/NADPH in cellular functions and cell death: regulation and biological consequences[J]. Antioxidants & redox signaling, 2008, 10(2): 179-206.

2. Gibon Y, Larher F. Cycling assay for nicotinamide adenine dinucleotides: NaCl precipitation and ethanol solubilization of the reduced tetrazolium[J]. Analytical biochemistry, 1997, 251(2): 153-157.

相關(guān)系列產(chǎn)品：
BC0440/BC0445  二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）活性檢測(cè)試劑盒
BC0630/BC0635  NADH氧化酶（NOX）活性檢測(cè)試劑盒
BC1030/BC1035  NAD激酶（NADK）活性檢測(cè)試劑盒

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